抗体制备之抗原设计

抗原的设计与制备是抗体生产工艺中十分关键的环节，设计或者制备得不好的抗原有可能不能免疫出抗体，因此在抗原设计过程中需要特别注意。

抗原必须具备两种特性：（1）免疫原性，是指抗原能诱导免疫系统发生免疫应答的特性；（2）反应原性，是指抗原能与其产生的抗体或效应细胞在体内或体外发生特异性反应的特性，涉及抗原分子与抗体分子或B/T细胞的抗原受体分子（BCR/TCR）间的相互作用。

抗原分子表面存在有能与抗体或受体分子结合的部位，称为抗原决定簇（antigen determinant）或表位（epie）。

制备抗体对抗原的要求：

（1）足够大的分子。大分子能留在机体内更长时间，有更多机会和免疫细胞接触，引起免疫细胞作出免疫反应（佐剂主要的作用就是油状物质包裹抗原在体内缓释，形成长期持续刺激）；而对于小分子，体内代谢可能很快将其排出体外，不能引发免疫细胞的反应。另外对于多肽或蛋白质类的抗原而言，每一个表位通常由6-8个氨基酸残基组成，而平均每5-10 kD才有一个表位，因此按几率来说，分子太小的多肽或蛋白是很难有一个表位的（除了人工设计的表位）。

（2）足够强的外源性。在个体形成的早期就对自身物质形成了免疫耐受，因此和机体内的物质相似甚至完全一样就很难引起机体的免疫应答。但如果是利用不被免疫系统影响区域的成份（如大脑、眼球、睾丸内部成份）则无需考虑。

（3）尽量复杂的结构。简单重复的物质不具有免疫原性，例如，明胶、淀粉的分子量非常大且外源性也很强，但是组成明胶的氨基酸多为直链氨基酸，因此它的免疫原性很弱。

（4）较好的可降解性。作为抗原，必须是可以降解的，塑料、不锈钢等难降解的物质免疫原性也很弱；D-型氨基酸组成的物质免疫原性也很弱，也是因为D-氨基酸组成的蛋白或多肽不能被机体降解。

在进行一个一个完整的抗体制备服务评估过程中，卡梅德生物会凭借多年的免疫学经验，为客户推荐合适的抗原制备方法。常规抗原可以分为以下几类，我们在此对其进行简单介绍：

（1）天然提纯蛋白抗原

天然蛋白是一种非常好的抗原，主要从机体提取纯化得到的天然蛋白保持了蛋白质本身结构（自身修饰，正确构象）特点，但是天然蛋白抗原的纯化难度比较大，且只有表达丰度较高、性质稳定的天然蛋白才具备可纯化条件。天然蛋白做抗原制备的抗体，一般适合于ELISA、免疫层析和免疫比浊等诊断用途抗体的制备。

（2）重组蛋白抗原

重组蛋白抗原制备常用的有原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统、昆虫细胞-杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。重组表达制备抗原一般会在蛋白序列上增加一段用于纯化的标签，不仅便于纯化更可以增加蛋白的可溶性和分子量。标签蛋白的可以切除或者在使用时用标签蛋白免疫吸附去除高免血清中针对标签的抗体。这类抗原制备一般适合于Western Blot、IHC、胶体金和免疫比浊等诊断类抗体的制备，只不过需要用含内源性蛋白标本进一步筛选验证。

（３）多肽抗原

多肽一半具有比较差的免疫原性，因此多肽需要偶联到蛋白质载体上才能形成大分子抗原，即完全抗原。常用的蛋白质载体主要有BSA、RSA、HSA、OVA、GST、MAP（多价抗原肽，主要指多聚Lys）。对于多肽而言，偶联到蛋白载体上很容易，多肽链上的羧基/氨基通过EDC（碳二亚胺）或EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)联用将多肽偶联到载体上。如果希望实现定向连接，在多肽合成时，N-端或C-端加上一个-SH(Cys)，通过Sulfo-SMCC试剂偶联到蛋白质载体上。多肽作为抗原主要难点在于多肽序列的设计，也即抗原表位的选取。多肽抗原与天然抗原或重组蛋白比较的优势在于抗原表位富集，更好刺激机体产生抗体。人工合成多肽制备抗原主要应用于抗原难以提取，或难于通过重组表达来实现的，或者蛋白抗原本身与机体内其他蛋白同源性过高的抗体制备。更多详情，可以了解卡梅德生物多肽合成与偶联服务

（4）小分子抗原

小分子抗原是指分子量比较小的化合物，通常来说，分子量越大、结构越复杂越容易制备高亲和力的抗体，含有芳香环的小分子更容易引起免疫反应。同样，小分子化合物必须与载体蛋白偶联才能形成完全抗原，小分子化合物与载体偶联一般需要借助于中间途径引入一些连接臂（Linker）连接到蛋白质载体上，不能直接与其结构上的某个基团直接偶联，如果强行偶联势必改变抗原结构，所以通常是先合成中间体来制备完全抗原，当小分子结构上具有-COOH或-NH2等活性基团时，一般可以直接进行偶联反应。现实情况是大部分小分子不具有上述活性基团，因此需要借助化学修饰方法进行基团改造，后续采用竞争法进行特异性小分子抗体制备。卡梅德生物拥有多年的小分子特异性单克隆抗体开发经验，欢迎各位老师，科学家进行技术咨询，更多小分子抗体制备详情，请查阅我们的详细页面或我们的技术家。

（5）全病毒颗粒抗原

全病毒作为抗原制备高免血清，一般需要行灭活处理，灭活的基本原理就是破坏病毒表面的囊膜成分，使其失去感染细胞或机体的能力。病毒颗粒作为抗原，如需制备高质量的中和抗体，则对其纯度有严格的要求，卡梅德生物能够为客户提供基因蔗糖密度梯度离心方法，IEX纯化获得超高纯度的病毒颗粒用于动物免疫并筛选各种形式的中和抗体。

（6）细菌颗粒抗原

制备全细菌高免血清一般用于建立细菌凝集免疫学实验。尽量选择菌体状态良好（细菌表面及其附属物，如鞭毛保存完整）的细菌颗粒抗原。为了防止病源传播扩散，免疫也需要灭活。免疫方法可以直接注射也可以与佐剂乳化之后再注射。用病原体（细菌或病毒）直接免疫制备的抗体效价一般不会太高，原因是机体面对病原体全部抗原/抗原表位“攻击”，免疫系统难以应付，针对每种抗原的抗体相对就较少。

（7）组织、全细胞或细胞组分抗原

如果需要制备细胞或者细胞器表面抗原的抗体，需要用组织、全细胞或者全细胞器进行免疫，免疫的时候尽量用完整的细胞。采用组织、全细胞或者细胞器免疫动物必须将细胞分离出来，并且越纯越好，尽量洗净血清和细胞碎片等。采用此方法免疫的主要优点在于：细胞具有完整的颗粒性和外源性，更容易刺激机体免疫，对于目的抗原来说其形态更趋于真实结构。免疫途径为：腹腔注射，注射细胞剂量为1.0×10⁵以上。

对于细胞膜和细胞质作为抗原，提取方法一般是采用低渗溶液稳定细胞核使其不破碎。单纯的提取细胞膜可以采用Ca²⁺匀浆离心法，将细胞膜沉淀下来。细胞器的提取主要是采用密度梯度离心法，对于密度非常相近的细胞器，需要更精确的密度梯度离心来实现，必要时可采用其他的辅助手段，具体案例具体分析。

mRNA抗原

mRNA抗原是将编码某种抗原蛋白的mRNA片段(通常来源于病毒）直接导入动物体细胞内，通过宿主细胞的蛋白质合成产生抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。通常用于疫苗制备。