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用荧光色素ICG标记人胚胎干细胞的实验步骤
点击次数：300 发布时间：2020/9/28 16:45:26
用荧光色素ICG标记人胚胎干细胞的实验步骤
胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
用荧光色素ICG标记人胚胎干细胞的实验步骤：
胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
用荧光色素ICG标记人胚胎干细胞的实验步骤：
1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品 ，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合；
2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 µL DMSO中溶解ICG；
3. 向混合物中加入 400 µL Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml；
4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞；
5. 在300 µL ICG 和 300 µL 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 µL 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为 10mg/ml,；
6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕；
7. 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基；
8. 加入5ml预热的 DMEM；
9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37 °C下孵育1h；
10. 孵育完全后移去染色液；
11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液；
12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好；
13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；
14. 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶；
15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟；
16. 在全培养基中悬浮细胞；
17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心；
18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离；
19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中；
20. 37 °C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮；
21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液；
22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；
23. 可进行活细胞成像了！
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仅用于科研（zhn2020.09.28）
原创作者：西安昊然生物科技有限公司
