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T4多聚核苷酸激酶
点击次数：35 发布时间：2022/7/15 16:19:25
T4多聚核苷酸激酶能够催化ATP的 γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链（双链或单链DNA或RNA）的 5’-羟基末端以及3’-单磷酸核苷上。T4 多聚核苷酸激酶还具有3’磷酸酶活性，将3’-磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3’-单磷酸核苷和脱氧3’-二磷酸核苷上水解掉。该酶经修饰后，其3’磷酸酶活性缺失，但仍保留了所有激酶的活性。
应用
DNA 或 RNA 5´ 末端的磷酸化，以便进行连接反应。
DNA 或 RNA 的末端标记，用作探针和进行 DNA 测序
将 3´ 端已经磷酸化的单核苷酸 5´ 磷酸化，制备pNp 底物，用于添加到 DNA 或 RNA的 3´ 端
对 3´ 端有磷酸基团的寡核苷酸的 5´ 端进行标记
活性定义
1 单位指 37℃条件下，30 分钟内催化1nmol 酸不溶性[32P] 掺入所需要的酶量。
储存
-20℃可保存3年。
使用注意事项
（1）1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液：70 mM Tris-HCl pH 7.6，10 mM MgCl2，5 mM DTT，37℃ 温育。
（2）热失活：65℃ 加热 20 分钟。
（3）在放射性标记实验中，可用 1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50pmol的γ-[32P] ATP和20单位的酶37℃温育30分钟。
（4）T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性，但是为了适用于高活力的放射性标记反应，在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。因此在磷酸化修饰核酸时请单独添加终浓度0.5~1mM ATP。
（5）要提高平齐末端或5’凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶，先将DNA溶液于70℃加热5分钟，然后冰上冷却，并加入5%（W/V）的PEG-8000。
（6）一般来说，进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下，T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃ 温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接，无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它DN段的去磷酸化状态，则需要在连接反应热失活T4多聚核苷酸激酶。
原创作者：上海圻明生物科技有限公司
