企业档案
- 会员类型：免费会员
- 工商认证： 【已认证】
- 最后认证时间：
- 法人：
- 注册号：
- 企业类型：生产商
- 注册资金：人民币万
联系我们
联系人：邓强
热门标签
技术文章
细菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒
点击次数：188 发布时间：2020/12/21 9:02:42
细菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒
产品及特点
细菌（Bacteria）广义的细菌即为原核生物是指大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区（nuclear region)（或拟核）的裸露 DNA 的原始单细胞生物，包括细菌（eubacteria）和古生菌（archaea）两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的类，是类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布广、个体数量多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。本公司开发细菌通用染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2. 引物根据细菌区设计，特异性高。
3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。
4. 管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期年。
自备试剂 DNA 模板、超纯水、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法
、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病
原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 用模板稀释液（好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的个是 PC（样品制备阳性对照），个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释
的（稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝，可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液）再加上定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。
9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性
分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用
第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 14810 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行
优化）。
四、数据处理
13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的
log 值，再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
原创作者：上海圻明生物科技有限公司
