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3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 试剂盒说明书
点击次数：186发布时间：2022/3/3 14:05:27
更新日期：2024/12/3 11:30:42
所 在 地：中国大陆
产品型号：
优质供应
详细内容
3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）
试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 ：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。
测定原理：
3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。
试剂组成和配制 ：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用加2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用加2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用加10 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
酶液提取：
①总PGK酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体PGK酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液），冰浴匀浆后于4℃，500g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆PGK酶活性，取沉淀加1mL提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定叶绿体中PGK酶活性。
建议测定总PGK酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的PGK，则按照步骤②提取粗酶液。
测定操作：
1. 分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 取1mL石英比色皿，依次加入500μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，50μL试剂四，200μL试剂五，100μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A1-A2
计算公式：
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
