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端粒酶检测试剂盒(QPCR法)
点击次数：194发布时间：2022/3/8 14:00:36
更新日期：2024/10/16 15:41:56
所 在 地：中国大陆
产品型号：
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优质供应
详细内容
【产品规格】
50T（50人份，分五个独立包装）
【产品说明】
端粒酶（Telomerase）是一种酶促核糖核蛋白复合物。其催化亚基（TERT）具有逆转录酶的特性， TERT被认为是端粒酶活性表达的关键组分，其编码的mRNA水平与端粒酶活性一致，与端粒酶的活化程度密切相关。因此，对端粒酶催化亚基的检测可以间接反映样本中端粒酶活性。
本产品试剂盒采用双色荧光qPCR（TaqMan探针法）检测端粒酶催化亚基TERT基因和内参基因GAPDH。通过提取细胞RNA，利用特异性逆转录引物进行逆转录反应，以cDNA为模板在单管中利用多重荧光定量PCR进行扩增反应（双重探针：FAM、Cy5）。选用293T细胞为阳性对照以及MRC-5细胞为阴性对照，通过∆∆CT法检测样本中TERT基因的相对表达量。该试剂盒具有以下特点：
1. 灵敏：双色探针，灵敏度高。
2. 稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
3. 可靠：含内参基因，避免假阴性。
4. 方便：操作简单，无需电泳步骤。
5. 定量：以CT值判断，可定量检测。
【运输及保存条件】
低温冷冻运输，避光-20℃保存，有效期6个月。
开盖后，4℃保存，有效期1周。
【操作步骤】
1. 逆转录反应
使用Trizol法抽提细胞RNA，RNA纯度A260/280在1.9-2.0之间。取1ug RNA使用Thermo逆转录试剂盒，将试剂盒中的Random Primer替换成Biowing®Specific Reverse Transcription Primers进行反转录反应得到
2
1.1 DNase I处理
RNA（µg）
DNase Buffer（µL）
DNase Ⅰ(µL)
DEPC 水(µL)
1
1
1
To 10
反应程序：37℃ 30min；加 EDTA 1 µL 后，65℃，10min
1.2 逆转录反应
RNA(µL)
Biowing®Specific Reverse Transcription
Primers(µL)
5×Buffer (µL)
RT(µL)
RI(µL)
dNTP(µL)
5.5
0.5
2
0.5
0.5
1
反应程序：20℃ 10min；42℃ 1h；72℃ 5min
2. qPCR反应体系及条件
2.1 阳性对照处理
将阳性对照cDNA进行2倍、4倍的梯度稀释，每个梯度建议三重复。
2.2 阴性对照处理
将阴性对照cDNA进行2倍、4倍的梯度稀释，每个梯度建议三重复。
2.3 样本处理
将待测样本cDNA进行2倍稀释作为测试浓度，每个样本做三重复。
反应体系（以20µL为例）
组分/样品管
待测样品(µL)
阳性对照管(µL)
阴性对照管(µL)
Biowing®Probe qPCR SuperMix
13.4
13.4
13.4
Sample
3
0
0
Positive Control（293T cell’s cDNA）
0
3
0
Negative Control（MRC-5 cell’s cDNA）
0
0
3
RNase Free Water
3.6
3.6
3.6
PCR仪设置（以ABI 7500为例）
步骤
循环数
温度
时间
1
预变性
1
94℃
5 min
2
变性
46
95℃
15 s
退火
58℃
1 min
延伸
72℃
1 min
温度选择：72℃延伸时收集荧光信号
通道选择：样本检测通道-FAM；内参检测通道-Cy5上海翼和应用生物技术有限公司
网址：http://www.biowing.com.cn/
邮箱：market@biowing.com.cn
服务热线：021-33559491
3
【基线设置】（以ABI 7500为例）
一般默认起始和终止基线位置为3-15个循环，应根据内参基因和TERT基因实际扩增曲线手动将基线起
始循环数调整为指数增长期之即可。
【阈值设置】（以ABI 7500为例）
内参阈值设定：以阳性对照2倍稀释cDNA定内参基因扩增曲线阈值，内参基因(Cy5)初始浓度的CT值定
为16±3；
TERT阈值设定：以阳性对照2倍稀释cDNA定TERT基因扩增曲线阈值，TERT基因(FAM)初始浓度CT值
的定为25±3。
【结果判读】
图1 左:阳性293T细胞的扩增曲线；右:阴性MRC-5细胞的扩增曲线
（蓝色为TERT基因曲线,黄绿色为内参基因曲线）
1. 阳性对照2倍稀释后TERT基因Ct值在25±3，内参基因Ct值在16±3，4倍稀释后TERT基因Ct值在26±3，内
参基因Ct值在17±3。TERT基因和内参基因之间∆CT维持在9±3，保持稳定。
2. 阴性对照经2倍、4倍梯度稀释后，TERT基因Ct值≥35（或检测不到），内参基因Ct值仍在13-20之间，
判定为端粒酶活性为阴性。
3. 结果说明
若待测样本内参基因Ct值在13-19之间，TERT基因Ct值＜35且扩增曲线正常，则样本端粒酶活性
为阳性。
若待测样本内参基因Ct值在13-19之间，TERT基因Ct值≥35且无明显的扩增曲线则样本无端粒酶
活性。
【说明】
1. 待测样本cDNA 2倍稀释作为模板，三次技术重复，不设置梯度稀释；阳性对照、阴性对照进行2倍、
4倍梯度稀释，建议分别做三重复；避免偶然误差的产生。
2. 如果阳性/阴性对照2倍稀释后内参基因Ct值＞19，表明参考品有降解或者试剂盒扩增效率下降。
3. 如果所有样本2倍稀释后内参基因Ct值＞19，表明试剂盒的扩增效率下降。
4. 如果阳性对照2倍稀释后TERT基因Ct值＞28，表明TERT基因检测系统失效。
