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脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)试剂盒

点击次数:169发布时间:2022/3/8 14:26:44

脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)试剂盒

更新日期:2024/12/3 11:30:42

所 在 地:中国大陆

产品型号:

简单介绍:脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)试剂盒

优质供应

详细内容

脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductaseDHAR)试剂盒说明书

                                                   

                                                         分光光度法50/48

 

    意:正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

DHAR存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR催化GSH还原DHA生成AsAGSSG,调控细胞AsA/DHA比值,是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性,可提高植物食品中AsA含量,进而提高植物食品的营养品质。

 

测定原理:

DHAR催化GSH还原DHA生成AsA,通过测定DHA减少速率,计算DHAR活性。

 

实验中所需仪器及设备:

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

 

试剂组成和配制:

试剂一:液体50 mL×1瓶,4保存。

试剂二:液体35 mL×1瓶,4保存。

试剂三:粉剂×1瓶(棕色),4保存。临用加入5mL蒸馏水充分溶解。

试剂四:粉剂×1瓶,4保存。临用加入5mL蒸馏水充分溶解。

 

粗酶液提取:

1. 按照组织质量(g试剂一(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4离心10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3,间隔7,总时间3min);8000g 4离心20min,取上清液置冰上混匀待测。

3.  血清等液体:直接测定。

 

DHAR测定操作:

1. 分光光度计预热30 min,调节波长到265nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min

3. 1mL石英比色皿中依次加入100μL试剂三、100μL试剂四和700μL 试剂二,后加100μL上清液迅速混匀后于265nm比色,记录30s150s的吸光值A1A2A=A2-A1

 

DHAR活性计算公式

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA 1个酶活单位

DHAR(nmol/min/mg prot) = A÷ε÷d×V反总×109÷(Cpr×V)÷T

= 92×A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

 

活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g鲜重) = A÷ε÷d×V反总×109÷(W×V÷V样总)÷T

= 92×A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟还原生成1nmol AsA 1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V÷V样总)÷T

= 92×A ÷细胞数量

4按液体体积计算

活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA 1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = A÷ε÷d×V反总×109÷V÷T

= 92×A

ε AsA265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol /cm109:摩尔分子换算成摩尔分子;d:比色杯光径,1 cmV反总:反应体系总体积,1mL=0.001 LV样:反应体系中加入上清液体积,100μL =0.1mLCpr:上清液蛋白浓度,mg/mLV样总:加入提取液体积,1mLW,样本质量,gT:反应时间,2 min

 

注意事项:

临用配制的试剂未使用完的4保存,3天内使用完。

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