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脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)试剂盒
点击次数:169发布时间:2022/3/8 14:26:44
更新日期:2024/12/3 11:30:42
所 在 地:中国大陆
产品型号:
优质供应
详细内容
脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意:正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
DHAR存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR催化GSH还原DHA生成AsA和GSSG,调控细胞AsA/DHA比值,是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性,可提高植物食品中AsA含量,进而提高植物食品的营养品质。
测定原理:
DHAR催化GSH还原DHA生成AsA,通过测定DHA减少速率,计算DHAR活性。
实验中所需仪器及设备:
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体50 mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体35 mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶(棕色),4℃保存。临用加入5mL蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用加入5mL蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取:
1. 按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3,间隔7,总时间3min);8000g 4℃离心20min,取上清液置冰上混匀待测。
3. 血清等液体:直接测定。
DHAR测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到265nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。
3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL试剂三、100μL试剂四和700μL 试剂二,后加100μL上清液,迅速混匀后于265nm比色,记录30s和150s的吸光值A1和A2,△A=A2-A1。
DHAR活性计算公式:
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T
= 92×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。
DHAR(nmol/min/g鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T
= 92×△A ÷W
(3). 按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。
DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 92×△A ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样÷T
= 92×△A
ε :AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol /cm;109:摩尔分子换算成纳摩尔分子;d:比色杯光径,1 cm;V反总:反应体系总体积,1mL=0.001 L;V样:反应体系中加入上清液体积,100μL =0.1mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间,2 min。
注意事项:
临用配制的试剂未使用完的4℃保存,3天内使用完。