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线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书
点击次数：174发布时间：2022/3/8 15:06:05
更新日期：2024/10/16 15:41:56
所 在 地：中国大陆
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详细内容
线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书
分光光度法25管/12样
注 意 ：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理：
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：1 mL×1瓶，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂五：6mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂九：液体10mL×1 瓶，室温保存。
定磷试剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
样本的处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，
超声3s，间隔10，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。
测定步骤：
1、酶促反应
| 试剂名称（μL） | 对照管 | 测定管 |
| 试剂四 | 25 | 25 |
| 试剂五 | 100 | 100 |
| 样本 |
| 125 |
混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min
| 试剂六 | 50 | 50 |
| 样本 | 125 |
|
混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液
2、定磷
| 上清液 | 170 | 170 |
| 定磷试剂 | 830 | 830 |
混匀，室温静置10min左右，在660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。
复合体Ⅴ活性计算：
标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T
=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)
V反总：反应体系总体积，3×10-4 L； V样：加入样本体积，0.125 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
