荧光定量PCR仪验证

1.    什么是荧光定量PCR仪

荧光定量PCR仪是1996 年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新型定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，在PCR进行的同时对其进行实时在线监控反应过程，结合配备的检测器对产物进行分析，*后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的仪器。所以荧光定量PCR仪产生的数据是在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集的。目前SYBR Green I染料法和TaqMan探针法是常用的两种qPCR检测方法。荧光定量PCR仪广泛应用于分子生物学研究如核酸定量分析；医学研究如病原体检测、肿瘤基因检测；食品病原微生物的检测、转基因食品检测等等。目前的病毒核酸检测绝大多数都是采用荧光定量PCR方法，对病毒RNA运用逆转录后PCR的方式扩增目的序列进行检测。

2.    荧光定量PCR仪的工作原理

将标记有荧光素的探针与模板DNA混合后，完成高温变性、低温复性、适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光；随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值（Cycle threshold，循环阈值，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数），同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

荧光染料：荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。

荧光探针：常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

3.    术语解释

(1) 基线：是指扩增曲线的水平部分。是指在PCR扩增反应的*初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线。

(2) 阈值：是一个荧光强度值，荧光域值必须设定在 PCR扩增的指数期。

(3) Ct值（阈值循环）是荧光定量PCR仪扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数。

(4) 扩增曲线: 是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，*后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。

(5) 荧光强度精密度：均热块测量孔在同一荧光条件下荧光强度重复测量值的一致性。

4.    为什么要对荧光定量PCR仪进行验证呢？

荧光定量PCR仪指通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监测反应过程的仪器。结合相应的软件可以对产物进行定性和定量分析，计算待测样品模板的初始浓度。我们都知道进行定性定量分析的仪器的要求都很高，况且荧光定量PCR仪比较敏感，结果比较精确，导致一点错误的参数或者误差就会出现完全相反的数据结果。荧光定量PCR检测仪在移动、使用一段时间后，例如温度系统引起的误差；阈值循环数示值误差、均匀度、精密度；通道峰值强度一致性；溶解温度漂移、温度比及各个要求的系数是否改变，能否达到我们需要的要求标准等等，都需要通过检测来验证它的各项参数是否处于正常范围内、是否符合要求，以防止该仪器在频繁使用过程没有对其进行合理的安排而产生误差，对数据结果造成影响。所以荧光定量PCR检测仪进行定期验证很重要，这样既能确保我们的仪器一直处于良好、灵敏的工作状态，也能保证我们做出的数据结果准确性，降低试验室的风险。

5.    荧光定量PCR仪验证的项目如下

a.  温度示值误差

b.  温度均匀度

c.  温度过冲量

d.  平均升温速率

e.  平均降温速率

f.  阈值循环数示值误差

g.  阈值循环数均匀度

h.  阈值循环数精密度

i.  通道峰值强度一致性

j.  线性灵敏系数

k.  溶解温度漂移

l.  溶解温度比

m.  荧光强度精密度

n.  样本测量精密度

o.  荧光线性相关系数

p.  样本线性相关系数

6.    荧光定量PCR仪操作过程中注意事项

a.  荧光定量PCR属于精密性试验，需要专业人员操作，在操作过程中需要注意各方面细节实验以保证实验的可靠可重复性。

b.  实验室注意分区：试剂准备间，样本处理间，PCR室，电泳间要有明确区分，各房间实验室的实验服不得混用；

c.  试剂准备间及样本处理间不处理实验相关的高浓度的核酸模板（如高浓度的标准品，PCR产物等）；

d.  减少频繁多次的走动，尤其去过电泳间之后当天不可进入其他房间；

e.  使用生物安全柜加样，不同位置的移液器不可混用，不要随意更换其位置；

f.  在检测体系中添加UNG酶系统用于避免PCR产物的污染。

g.  条件允许，尽量使用一次性带滤芯移液枪吸头，使用非带滤芯的吸头的时候，移液器尽量不要使用量程移液，移液器尽量避免使用第二档，防止打出气泡，回弹污染移液器。

h.  加样后将荧光定量PCR管瞬时离心，不要在荧光定量PCR管上做任何标志，不能用手碰到PCR管盖上的采光部位，以免影响实验的准确性。

i.  荧光探针应避光保存，加入核酸模板后应尽快上机，以防探针淬灭。

7.    对与荧光定量PCR仪问题解答

(1)      为什么荧光定量PCR的扩增产物片段长度应该控制在80-300bp范围内？

答：每个基因序列长短不一，有的好几kb，有的几百bp，但是我们在设计引物的时候只需要要求产物长度80-300bp，太短或者太长都不适合做荧光定量PCR检测。产物片段太短，无法跟引物二聚体区分，引物二聚体的长度大概在30-40bp，小于80bp很难区分是引物二聚体还是产物。产物片段太长，超过300bp，容易致使扩增效率低下，不能有效的检测出该基因的量。打个比方，我们统计某个试验室有多少个人，只需要数一下有几张嘴就可以了，在检测基因的时候也是一样的，只需要检测某个基因的某一段序列来代表整个序列即可。如果既要数多少张嘴也要数多少个鼻子、耳朵等反而容易数错。

(2)      引物设计*佳长度是多少？

答：一般来说，引物长度大概在20-24bp范围是比较好的。当然我们在设计引物的时候一定要注意引物的TM值，因为这个关系到*佳退火温度。经过大量的实验证明，60℃是一个比较好的TM值。退火温度太低容易导致非特异性扩增，退火温度太高一般会导致扩增效率比较低，扩增曲线起峰比较晚，CT值延后。

(3)      采集样本量的多少会不会影响实验结果？答：不会。

(4)      反转录酶效率高低会不会影响实验结果？

答：不会。这取决于各公司对于反转录试剂盒的优化能力。

(5)      Taq酶的效率会不会影响实验结果？

答：Taq酶的效率影响比较大，一般要求用热启动Taq酶，且效率要比较高才行，商品化的荧光定量试剂盒，每个厂家都会在自己的产品的基础上，把效率优化到好的状态，接近于100%，效率太低实验结果不可用。

(6)      荧光染料的多少会不会影响实验结果？

答：当然是有影响的。荧光染料过于饱和，会导致某些仪器出现噪点干扰；荧光染料不饱和，荧光值太低，导致提前进入平台期，扩增曲线平缓。在荧光定量实验中主要看CT值，因此后期扩增曲线进入平台期显得不那么重要，只是图形不够美观罢了，如果二者必选其一的话，宁愿选择荧光染料略微不饱和。在使用同一公司的同一款产品时，该影响基本可以忽略。

(7)      操作过程中的误差会不会影响？

答：操作过程有一定的影响，主要体现在均一性上。均一性是指体系内的所有组分均匀的混合在一起，瞬时离心可以解决均一性问题。对于新手来说，调整PCR体系在20ul以上，过小的体系更容易产生误差。如果退火温度优化得合适，引物浓度对CT的影响会降到zui低。所以有的操作误差（比如引物浓度）是可以通过优化退火温度来避免的。

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