主要杂质包括宿主细胞核酸、宿主细胞蛋白（包括令人生畏的染色质形式）、衣壳聚集体、衣壳-DNA 复合物、以及具有不同核酸填充物不同组合的衣壳（从部分完整衣壳（partial capsid）装载到包含进宿主细胞 DNA ）。

如果说空/实衣壳分离前的步骤（优化宿主细胞中的AAV生产，裂解，色谱前步骤，如固相萃取 – 检查Kryptonase，絮凝，酸化，疏水交换色谱，超滤/渗滤和AAV捕获 - 如CIMmultus SO3阳离子交换或亲和层析）主要是针对宿主细胞DNA和不同形状和形式的宿主蛋白，那么实衣壳分离就是接下来的第二个任务， 也就是抛光步骤。

需要补充的一点是，没有适用于所有生产工艺的标准流程。不同的AAV血清型，宿主细胞的选择，裂解方案以及下游的不同步骤会产生独特的样品，必须根据样品定制实衣壳分离方案。

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色谱分离方法工具箱

为此，我们开发了一个色谱分离方法工具箱，可用于寻求*佳纯度和回收率。下面的研究结果是在分析型色谱柱（CIMac系列）上进行的，其中注入了CEX-SO3纯化的样品。通过这些结果也可用于了解生产规模上使用 CIMmultus的情况（尽管考虑到分辨率略有下降 - 分析柱已根据分辨率进行了优化）。

CIMac™ AAV Empty/Full（等同：CIMmultus QA）是一种基于季胺（QA）的色谱柱（一种强阴离子交换柱），其中空衣壳和实衣壳的分离基于衣壳群体之间的电荷差异。AAV的洗脱是在碱性缓冲液中使用NaCl梯度实现的。

CIMac PrimaS™ Empty/Full（等同：CIMmultus PrimaS）采用离子交换-氢键多模式配基，可在pH梯度模式下分离空衣壳和实衣壳。这与季胺（QA）不同，QA中（假设所有其他条件保持不变）增加pH值会导致衣壳的强烈结合，这会导致洗脱时向更高电导率的转变。在较高的pH值下上样将增加分离效果。

CIMac™ PrimaT-Beta（等同：CIMmultus PrimaT）是一种用于空衣壳和实衣壳完全分离的多模式色谱柱，其功能等同于弱阴离子交换柱，此外该色谱柱还通过氢键和金属离子与样品相互作用。它可以使用MgCl₂和NaCl洗脱梯度的组合来分离空衣壳和实衣壳的不同亚群。

上面介绍的工作基于 Zvanut 等人的科学海报（2022），BIA Separations。

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方法

样品是使用CEX - CIMmultusTM SO3部分纯化的AAV2 / 8。PATfix系统（BIA Separations）用于色谱分离：

检测器设置：

• 电导率和pH值

• 吸光度（260 nm，280 nm），50mm UV流通池

• 荧光（激发/发射：280/348 nm）

• 光散射（角度：90°）

使用的色谱柱：

CIMac™ AAV Empty/Full 0.1 mL 分析柱（1.3 μm 通道）;货号：110.8503-1.3

CIMac PrimaS™ Empty/Full 0.1 mL 分析柱（2 μm 通道）;货号：BIA-110.8504-2

CIMac™ PrimaT 0.1 mL Beta 分析柱（2 μm 通道）; 货号：BETA 0009

流动相和色谱方法

流速：1 mL/min

使用一系列结合和洗脱缓冲液（缓冲液A 30 CV、缓冲液B 30 CV、缓冲液A 30 CV）平衡色谱柱。进样后和梯度开始之前，允许20 CV的结合缓冲液。

进样前先运行3个用结合缓冲液代替的空白样品。如果电导率和pH值尚未稳定，可以运行更多。

为了减少样品残留，注入在定量限度内仍能产生结果的*小量（可能需要进行测试）。

CIMac™ AAV Empty/Full

• 缓冲液A：20 mM BTP + 2 mM 氯化镁 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1 % poloxamer 188，pH 9.0

• 缓冲液B：20 mM BTP + 2 mM 氯化镁 + 200 mM 氯化钠 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer 188，pH 9.0

NaCl梯度：从100%缓冲液A到50%缓冲液B的5分钟梯度。

CIMac PrimaS™ (AAV)

• 缓冲液A：10 mM BTP + 10 mM TRIS + 2 mM 氯化镁 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer 188，pH 8.0

• 缓冲液B：10 mm BTP + 10 mM TRIS + 2 mM 氯化镁 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1 % poloxamer 188，pH 9.5*

*添加NaCl以实现缓冲液A和缓冲液B的相同电导率。

pH 梯度：从 100% 缓冲液 A 到 100% 缓冲液 B 的 2.5 分钟梯度。

CIMac™ PrimaT-Beta

• 缓冲液A：25 mM HEPES、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 7.0

• 缓冲液B：50 mM Tris、13.6 mM 硼 盐、1 % 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

• 缓冲液C：50 mM Tris、9.6 mM 硼 盐、50 mM 氯化镁 2、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

• 缓冲液D：50 mM Tris、12 mM 硼 盐、2 M 氯化钠、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

梯度：从100%缓冲液B到100%缓冲液C的2.5分钟梯度，然后从100%缓冲液B到100%缓冲液D的2.0分钟梯度。

根据基于UV信号的标准方程计算分辨率：R = 2 t_F − t_E / w_F + w_E ，其中 t_F 和 t_E 是保留时间，w_F 和 w_E 是AAV实衣壳和空衣壳基线处的峰宽度。根据荧光计算空衣壳和实AAV衣壳的百分比（%E和%F）。将光散射添加到色谱图中进行比较。

结果和讨论

比较所有三种色谱柱的结果，估算出的AAV空壳率和实壳率是近似的，即52%空壳率和48%实壳率。在这种情况下，使用荧光信号会产生比UV更接近实际状态的结果。主要是因为与紫外线相比，荧光信号下AAV中的DNA装载对读数的影响较小，而核酸对紫外信号的吸收相当显著，因此会高估了实衣壳的比例。荧光信号可实现更微量级别的检测和定量。

然而事情并不这么简单。色谱分离的不同目的意味着我们对色谱分离也有不同的要求。对于分析目的而言，良好的分辨率，但同样重要的是测量两种衣壳的色谱峰面积的难易程度。这里基于QA色谱柱的结果显示，当使用梯度方法时，很少能提供基线分离，但是空衣壳聚集在一个峰，实衣壳聚集到另一个峰，使得进行面积测量相对容易。如果始终使用相同的标准进行定量（空衣壳峰在两峰之间的点结束），则误差是可重现的，因此可以保证可重现的并且可靠的分析。
 

 PrimaS色谱柱提供轮廓相似的色谱图，其中两个峰似乎相距更远（尽管稀释倍数更高），但分辨率会降低。这确实意味着对于分析目的而言QA色谱柱可能更合适，但对于制备目的PrimaS更具有优势。补充一点，这些结论是基于已有案例，可能并非在所有情况下都是正确的——两种色谱柱都可以用于分析和制备测试。

 另一方面，PrimaT色谱柱提供了非常不同的特异性，保证了空衣壳和实衣壳的不同亚群分离。根据已有的使用经验，这可能是需要的或避免的。对于制备目的，需要收集和分析洗脱物质的馏分，并考虑随后应如何富集这些馏分以获得*佳纯度。对于分析目的，PrimaT色谱柱确实可以让我们更深入地了解空衣壳和实衣壳的组成，但在空壳和实壳被认为是同质的情况下，可能更难进行一般性测量。我们预计未来将需要对亚种群结构有更多的了解，因此PrimaT色谱柱提供了一个可以在此类场景应用的工具。PrimaT色谱柱也可以测试用于制备目的。

 一直以来，BIA Separations是质粒DNA、AAV、mRNA高效率纯化的。不仅提供整体柱及平台方法，还提供定制的纯化服务，以满足质粒DNA、AAV、mRNA规模化生产的纯化需求。

原创作者：上海精瑞科学仪器有限公司