产品货号：BA1526

产品规格：100管/48样

产品说明:

NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。

注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制： 

1. 试剂一：临用加入4mL蒸馏水，充分溶解。

2. 试剂二：临用加入4mL提取液，沸水浴中搅拌溶解。

3. 标准品：20μmol/mL标准酪氨酸。

需自备的仪器和用品： 

研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5mLEP管、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。或直接称取0.1g酶制品，加入1mL提取液，置冰上待测。

二、测定步驟

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一、试剂二和试剂三置于30℃水浴保温30min以上。

3. 标准溶液的配制：临用将20μmol/mL标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/mL标准溶液使用，现用现配。

4. 样本测定 (1.5mLEP管中分别加入下列试剂) ：

三、NP活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。

NP活性（U/mg prot）=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V1÷（Cpr×V2）÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2. 按样本质量计算

酶活单位定义：30℃每克样本每分钟催化水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。

NP活性（U/g质量）=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V1÷（W×V2÷V3）÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W

C标准品：标准酪氨酸溶液浓度，0.25μmol/mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V1：酶促反应总体积，0.1mL；V2：加入反应体系中粗酶液体积，20µL=2×10^-2mL；V3：粗酶液总体积，1mL；T：催化反应时间，10min。

注意事项：

若反应较弱，（A测定管-A对照管）差值较小，可适当延长反应时间（20-30min），即步水浴时间，计算酶活时对公式进行修改。

实验实例：

1. 取0.1g兔脾脏加入1mL提取液冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清，即粗酶液，置冰上，之后照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.132-0.123=0.009，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.259-0.045=0.214。按样本质量计算酶活得：

NP活性（U/g质量）=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W=0.125×0.009÷0.214÷0.1=0.0526 U/g质量。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司