谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定试剂盒（紫外分光光度法）

注意：正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号：BA1117

产品规格：50管/48样

产品简介：

GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶(通常昆虫中GR被TrxR取代)。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。

GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时不断消耗NADPH生成NADP⁺；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率；来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。

产品内容：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用加入5.0 mL蒸馏水，混匀。

试剂三：液体×1支，4℃保存。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、 1mL石英比色皿和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（ml）1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（ml）为500-1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂一），冰浴超声超声破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、GR 测定操作： 

1、分光光计预热30 min以上，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置于25℃(普通物质)或者37℃(哺乳动物)中预热30min以上。

3、空白管：取1mL石英比色皿，加入850µL试剂一，100µL试剂二，50µL试剂三，充分混匀，于340nm处测定10s 和190s吸光度，记为A1和A空2，△A空白管= A空1-A空2。

4、测定管：取1mL石英比色皿，加入750µL试剂一，100µL试剂二， 100µL上清液，50µL试剂三，充分混匀，于340nm处测定10s和190s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管= A测1-A测2。

注意：空白管只需要测定一次。

三：GPX活性计算： 

(1) 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1µmol NADPH氧化。

GR酶活(U/mg prot)= [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(Cpr×V样)÷T

=0.536×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

(2) 按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中， pH8.0条件下，每克样本每分钟催化1µmol NADPH氧化。

GR酶活(U/g)= [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(W×V样÷V样总)÷T

=0.536×(△A测定管-△A空白管)÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每10⁴个细胞每分钟催化1µmol NADPH氧化。

GR酶活(U/10⁴ cell)= [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=0.536×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量

ε：NADPH摩尔消光系数 6.22×10³L/mol/cm；V反总：反应体系总体，1000µL=0.001 L；10⁶：1 mol=1×10⁶µmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入反应体系中上清液体积，100µL =0.1mL；V样总：加入提取液体体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min。

注意事项： 

1、样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

2、试剂二须现配现用，配置完后，置于冰上；

3、测定须先用1～2个样做预实验，确保180s内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2～5倍；

4、细胞中GR活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司