4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）活性检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA1006

产品规格：100管/96样

产品简介

4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木质素生物合成的关键酶，主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯，这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下测有特征吸收峰，测定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反应4CL活性。

产品内容： 

溶液的配制：

1. 提取液：内含不溶物，使用摇匀；

2. 试剂二：临用加入3mL蒸馏水溶解，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3. 试剂四：临用用4mL蒸馏水溶解备用，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；

4. 试剂五：加入1mL蒸馏水溶解，临用用蒸馏水稀释40倍后备用，现用现配；

5. 工作液的配制：按体积比将试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=1:1:1:1的比例配制工作液，现用现配。

注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤（仅供参考）：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至333nm，蒸馏水调零。

2. 操作表（在0.5mL EP管中进行下列操作）：

三、4CL活计算 

A、按微量石英比色皿计算： 

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V样×Cpr) ÷T

=15.87×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算：

单位定义：每g组织每分钟生成1nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL（U/g质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(W×V样÷V样总) ÷T

=15.87×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞数量计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=0.03174×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

B、按96孔UV板计算： 

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。

注意事项：

1. 若ΔA大于0.5，将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。

2. 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。

3. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司