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几丁质酶活性检测试剂盒(微量法)
产品货号:BA1177
产品规格:100管/48样
产品简介:
几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨),以及真菌类的 细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解,具有抵御真菌侵染的作用,成为抗真菌病害的研究热 点。
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖,进一步与3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物,在540nm处有 特征吸收峰,吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。
注意:实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂二 | 液体5mL×1瓶 | 2-8℃ |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制:
1. 试剂一:用摇匀。
2. 标准品:5mg N-乙酰氨基葡萄糖,临用加入2.27mL蒸馏水配成10μmol/mL的标准溶液。
需自备的仪器和用品:
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积 (mL)为 1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液) 进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心20min,取上清,置冰上待测。
真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声破碎细胞(功率300w,超声3s,间隔7s,总时间3min);然后10000g,4℃,离心20min,取上清置于冰上待测。
培养液:直接测定。
二、测定步骤
1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min。波长调至540nm,蒸馏水调零。
2. 将标准溶液用蒸馏水稀释为5、4、3、2、1μmol/mL 的标准溶液备用。
3. 在EP管中分别加入:
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本(µL) | 100 | 100 | - | - |
标准溶液(µL) | - | - | 100 | - |
蒸馏水(µL) | - | - | - | 100 |
试剂一(µL) | 100 | - | 100 | 100 |
混匀,37℃水浴1h,沸水浴5min。 | ||||
试剂一(µL) | - | 100 | - | - |
8000rpm常温离心10min,分别取上清液160μL于新的EP管中,再加入下列试剂 | ||||
试剂二(µL) | 40 | 40 | 40 | 40 |
混匀,沸水浴反应10min,立即置于冰上至室温。于微量玻璃比色皿或96孔板中测定每管在540nm 下的吸光度,记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。 |
三、几丁质酶活的计算
1. 标准曲线的绘制:以ΔA标准为y轴,标准溶液浓度为x轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入标准方程中,得到x(μmol/mL)。
2. 按照样本重量计算
酶活性定义:37℃下,每g组织每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(U/g质量)=x×V样÷(V样÷V样总×W)÷T=x÷W
3. 按照蛋白质浓度计算
酶活性定义:37℃下,每mg蛋白每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。 几丁质酶活性(U/mg prot)=x×V样÷(V样×Cpr)÷T =x÷Cpr
4. 按照细胞数量计算
酶活性定义:37℃下,每104个细胞每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。 几丁质酶活性(U/104cell)=x×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T =x÷细胞数量
5. 按照培养液体积计算
酶活性定义:37℃下,每mL培养液每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(U/mL)=x×V样÷V样÷T =x
V样:反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓 度,mg/mL;T:反应时间,1h;细胞数量:以万计。
注意事项:
1. 反应结束后尽快进行比色。
2. OD值大于1.5,样本适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数;或者缩短37℃水浴时间到X小时(如0.5小时),按照原先计算公式得到的结果再除以X。
原创作者:内蒙古邦美管道疏通有限公司