几丁质酶活性检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA1177

产品规格：100管/48样

产品简介：

几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌类的 细胞壁中。而几丁质酶（EC 3.2.1.14）可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热 点。

几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物，在540nm处有 特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。

注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1. 试剂一：用摇匀。

2. 标准品：5mg N-乙酰氨基葡萄糖，临用加入2.27mL蒸馏水配成10μmol/mL的标准溶液。

需自备的仪器和用品：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积 (mL)为 1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液） 进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

培养液：直接测定。

二、测定步骤 

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min。波长调至540nm，蒸馏水调零。

2. 将标准溶液用蒸馏水稀释为5、4、3、2、1μmol/mL 的标准溶液备用。

3. 在EP管中分别加入：

三、几丁质酶活的计算 

1. 标准曲线的绘制：以ΔA标准为y轴，标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入标准方程中，得到x（μmol/mL）。

2. 按照样本重量计算

酶活性定义：37℃下，每g组织每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/g质量）=x×V样÷（V样÷V样总×W）÷T=x÷W

3. 按照蛋白质浓度计算

酶活性定义：37℃下，每mg蛋白每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。 几丁质酶活性（U/mg prot）=x×V样÷（V样×Cpr）÷T =x÷Cpr

4. 按照细胞数量计算

酶活性定义：37℃下，每10⁴个细胞每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。 几丁质酶活性（U/10⁴cell）=x×V样÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T =x÷细胞数量

5. 按照培养液体积计算

酶活性定义：37℃下，每mL培养液每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/mL）=x×V样÷V样÷T =x

V样：反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓 度，mg/mL；T：反应时间，1h；细胞数量：以万计。

注意事项： 

1. 反应结束后尽快进行比色。

2. OD值大于1.5，样本适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数；或者缩短37℃水浴时间到X小时（如0.5小时），按照原先计算公式得到的结果再除以X。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司