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技术文章
Annexin V PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒
点击次数:14 发布时间:2023/11/20 11:12:43
产品货号: BA1984
产品规格: 20T/50T/100T
产品简介:
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS 的特性,对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以采用AnnexinV与7-AAD双染的方法,通过流式检测细胞早期凋亡。
产品组成:
产品名称 | 20T | 50T | 100T | 保存条件 |
4× (Binding Buffer 4×) | 4ml | 10ml | 20ml | 2-8℃ |
7-AAD Viability Staining Solution | 0.2ml | 0.5ml | 1.0ml | 2-8℃ |
rhAnnexin V/PE | 0.1ml | 0.25ml | 0.5ml | 2-8℃ |
操作步骤(仅供参考):
1. 细胞样品的准备:
a) 对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清;
b) 对于悬浮细胞:1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清;
2. 用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4×结合缓冲液+12ml去离子水);
3. 用1×结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1-5×106 /ml;
4. 取100µl的细胞悬液于5ml流式管中,加入5µl Annexin V/PE混匀后于室温避光孵育5分钟;
5. 加入10µl 20ug/ml的7AAD,并加400µl PBS,立刻进行流式检测。
实验设计:
1)未转染细胞
空白管:阴性对照组细胞,不加Annexin V/PE,7AAD,用于调节电压。
单染管:阳性对照组细胞,只加Annexin V/PE或只加7AAD,用于调节补偿。
检测管:处理的细胞,加Annexin V/PE,7AAD。用空白管和单染管调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。 2)转染GFP
未转染空白管:未转染细胞,不加Annexin V/PE,7AAD,用于调节电压。
未转染单染管:未转染且有明显凋亡的细胞,只加Annexin V/PE或只加7AAD,用于调节补偿。
转染GFP空白管:转染GFP对照组细胞,不加Annexin V/PE,7AAD,用于调节补偿。
检测管:处理的细胞,加Annexin V/PE,7AAD。调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。
注意事项:
1. Annexin V是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和,而PS在不同种属间没差异。在正常细胞中,PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,PS由脂膜内侧翻向外侧。
2. 低浓度胰酶消化,轻柔吹打贴壁细胞2~3次,离心机4℃1000rpm 5min离心,处理得当的话,胰酶造成损伤可以控制在5%以内,有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3. 先加PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断,而且PI本身对细胞也是有毒性的,对实验结果影响会比胰酶大,不建议这样做。
4. Annexin V是Ca依赖的蛋白,所以不能加入EDTA,防止EDTA螯合了Ca离子从而影响Annexin V,进而影响结果。
5. 用流式检测凋亡时,7AAD受时间的影响很大,因标记了7AAD后会加大细胞毒性,随着时间延长会导致7AAD的染色增加,特别是检测早期凋亡时,如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外,误差会明显加大。一般7AAD加上后立刻上机,然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以,但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。
保存条件:2-8℃避光,勿冷冻。6个月有效。
原创作者:上海尚宝生物科技有限公司