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技术文章
乳酸含量(LA)检测试剂盒(微量法)
点击次数:12 发布时间:2024/5/27 11:37:00
产品货号:BA1259 产品规格:100管/48样 产品简介: 乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物,与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关,乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸,同时使NAD+还原生成NADH和H+,H+传递给PMS生成的PMSH2还原MTT生成紫色物质,在570nm处有特征吸收峰。 技术指标: 检出限:0.0771μmol/mL 线性范围:0.078-5μmol/mL 注意:实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。 产品组成: 试剂名称 规格 保存条件 提取液一 液体50mL×1瓶 4℃ 提取液二 液体8mL×1瓶 4℃ 试剂一 液体6mL×1瓶 4℃ 试剂二 液体34μL×1支 4℃ 试剂三 粉剂×1瓶 -20℃ 试剂四 粉剂×1瓶 4℃ 试剂五 粉剂×1瓶 -20℃ 试剂六 液体2mL×1瓶 4℃ 标准品 粉剂×1支 4℃ 溶液的配制: 1. 试剂二:液体置于试剂瓶内EP管中。临用按试剂二(V):蒸馏水(V)=10μL:450μL的比例配制试剂二溶液,现用现配; 2. 试剂三:临用加入4mL蒸馏水充分溶解,可分装后-20℃保存,避免反复冻融,-20℃保存一周; 3. 试剂四:临用加4mL蒸馏水充分溶解,4℃保存一周; 4. 试剂五:临用每瓶加入3mL蒸馏水混匀,可分装后-20℃保存,避免反复冻融,-20℃保存一周; 5. 标准品:临用加入1.04mL蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液; 6. 显色液的配制:临用根据用量按照试剂三(V):试剂四(V)=1:1的比例充分混匀,现配现用。 需自备的仪器和用品: 天平、研钵/匀浆器、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、乙醇和蒸馏 水。 操作步骤: 一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 1. 组织:按照质量(g):提取液一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于4℃,12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,4℃ 12000g离心10min后取上清待测。 2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3,间隔7,总时间3min);于4℃,12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,4℃ 12000g离心10min后取上清待测。 3. 血清(浆):取100μL血清(浆)加入1mL提取液一,4℃ 12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,12000g离心10min后取上清待测。 二、测定步骤 1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,波长调至570nm,分光光度计用乙醇调零。 2. 标准液的稀释:将100μmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释为2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL的标准溶液待测。 3. 加样表: 测定管 对照管 标准管 空白管 样本(μL) 10 10 - - 标准品(μL) - - 10 - 蒸馏水(μL) - 10 - 10 试剂一(μL) 40 40 40 40 试剂二(μL) 10 - 10 10 试剂五(μL) 20 20 20 20 在EP管中充分混匀,于37℃水浴准确反应20min。 试剂六(μL) 6 6 6 6 显色液(μL) 60 60 60 60 37℃避光反应20min后于25℃,10000rpm离心10min,去上清,留沉淀。 乙醇(μL) 200 200 200 200 充分溶解沉淀后,于570nm处测定吸光值,分别记为A测定管,A对照管,A标准管,A空白管,计算ΔA测定=A测定管-A对照管;ΔA标准= A标准管-A空白管。 三、乳酸含量的计算 标准曲线的绘制 1. 以各标准溶液浓度为x轴,以其对应的吸光值(ΔA标准)为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入公式中得到x(μmol/mL)。 2. 乳酸含量计算 (1)按照样本蛋白浓度计算 LA含量(μmol/mg prot)=x×V样本÷(V样本×Cpr)=x÷Cpr (2)按照样本质量计算 LA含量(μmol/g质量)=x×(V上清+V提取液二)÷(W×V上清÷V提取液一)=1.1875×x÷W (3)按照细胞数量计算 LA含量(μmol/106 cell)=x×(V上清+V提取液二)÷(5×V上清÷V提取液一)=0.2375×x (4)按照液体体积计算 LA含量(μmol/mL)=x×(V上清+V提取液二)÷ [V液体×V上清÷(V提取液一+V液体)]=13.0625×x V样本:加入的样本体积,0.01mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度需自行测定;V上清:提取时上清液体积,0.8mL;V提取液二:加入提取液二的体积,0.15mL;V提取液一:加入的提 取液一体积,1mL;5:细胞数量,5×106个;V液体:液体样本体积,0.1mL。 注意事项: 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。 实验实例: 1. 取0.1g兔心加入1mL提取液一进行匀浆研磨离心,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,离心取上清后稀释5倍,之后按照测定步骤操作,使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.591-0.069=0.522,根据标准曲线 y=0.412x-0.0214,x=1.319,按样本质量计算含量得: LA含量(μmol/g质量)=1.1875×x÷W×稀释倍数=1.1875×1.319÷0.1×5=78.32μmol/g质量。 2. 取100μL小鼠血清加入1mL提取液一,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,离心取上清,之后按照测定步骤操作,使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.572-0.211=0.361,根据标准曲线y=0.412x-0.0214,x=0.928,按照液体体积计算含量得: LA含量(μmol/mL)=13.0625×x=13.0625×0.928=12.122μmol/mL。 相关发表文献: [1] Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al.Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959) [2] Xiaojin Luo,Weihua Shi,Haoming Yu,et al. Wearable Carbon Nanotube-Based BioSensors on Gloves for Lactate. Sensors. October 2018;(IF3.031) [3] Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178. 参考文献: Eolbergrová J, MacMillan V, Siesjö B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cylasmic NADH/NAD+ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.
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