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技术文章

乳酸含量(LA)检测试剂盒(微量法)

点击次数:12 发布时间:2024/5/27 11:37:00

 乳酸含量(LA)检测试剂盒(微量法)

产品货号:BA1259

 

产品规格:100/48

 

产品简介:

乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物,与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关,乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸,同时使NAD+还原生成NADHH+H+传递给PMS生成的PMSH2还原MTT生成紫色物质,在570nm处有特征吸收峰。

 

技术指标:

检出限:0.0771μmol/mL

线性范围:0.078-5μmol/mL

注意:实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

 

产品组成:

试剂名称

规格

保存条件

提取液一

液体50mL×1

4℃

提取液二

液体8mL×1

4℃

试剂一

液体6mL×1

4℃

试剂二

液体34μL×1

4℃

试剂三

粉剂×1

-20℃

试剂四

粉剂×1

4℃

试剂五

粉剂×1

-20℃

试剂六

液体2mL×1

4℃

标准品

粉剂×1

4℃

溶液的配制:

1. 试剂二:液体置于试剂瓶内EP管中。临用按试剂二(V):蒸馏水(V=10μL450μL的比例配制试剂二溶液,现用现配;

2. 试剂三:临用加入4mL蒸馏水充分溶解,可分装后-20℃保存,避免反复冻融,-20℃保存一周;

3. 试剂四:临用加4mL蒸馏水充分溶解,4℃保存一周;

4. 试剂五:临用每瓶加入3mL蒸馏水混匀,可分装后-20℃保存,避免反复冻融,-20℃保存一周;

5. 标准品:临用加入1.04mL蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液;

6. 显色液的配制:临用根据用量按照试剂三(V):试剂四(V=11的比例充分混匀,现配现用。

 

需自备的仪器和用品: 

天平、研钵/匀浆器、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、乙醇和蒸馏 水。

 

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 组织:按照质量(g):提取液一体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于4℃12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL提取液一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3,间隔7,总时间3min);于4℃12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

3. 血清(浆):取100μL血清(浆)加入1mL提取液一,4℃ 12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,12000g离心10min后取上清待测。

二、测定步骤 

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,波长调至570nm,分光光度计用乙醇调零。

2. 标准液的稀释:将100μmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释为2.51.250.6250.31250.156250.078μmol/mL的标准溶液待测。

3. 加样表:

 

测定管

对照管

标准管

空白管

样本(μL

10

10

-

-

标准品(μL

-

-

10

-

蒸馏水(μL

-

10

-

10

试剂一(μL

40

40

40

40

试剂二(μL

10

-

10

10

试剂五(μL

20

20

20

20

EP管中充分混匀,于37℃水浴准确反应20min

试剂六(μL

6

6

6

6

显色液(μL

60

60

60

60

37℃避光反应20min后于25℃10000rpm离心10min,去上清,留沉淀。

乙醇(μL

200

200

200

200

充分溶解沉淀后,于570nm处测定吸光值,分别记为A测定管,A对照管,A标准管,A空白管,计算ΔA测定=A测定管-A对照管;ΔA标准= A标准管-A空白管。

三、乳酸含量的计算

标准曲线的绘制

1. 以各标准溶液浓度为x轴,以其对应的吸光值(ΔA标准)为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入公式中得到xμmol/mL)。

2. 乳酸含量计算

(1)按照样本蛋白浓度计算

LA含量(μmol/mg prot=x×V样本÷V样本×Cpr=x÷Cpr

(2)按照样本质量计算

LA含量(μmol/g质量)=x×V上清+V提取液二)÷W×V上清÷V提取液一)=1.1875×x÷W

(3)按照细胞数量计算

LA含量(μmol/106 cell=x×V上清+V提取液二)÷5×V上清÷V提取液一)=0.2375×x

(4)按照液体体积计算

LA含量(μmol/mL=x×V上清+V提取液二)÷ [V液体×V上清÷V提取液一+V液体)]=13.0625×x

V样本:加入的样本体积,0.01mLW:样本质量,gCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度需自行测定;V上清:提取时上清液体积,0.8mLV提取液二:加入提取液二的体积,0.15mLV提取液一:加入的提

取液一体积,1mL5:细胞数量,5×106个;V液体:液体样本体积,0.1mL

 

注意事项:

如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

 

实验实例: 

1. 0.1g兔心加入1mL提取液一进行匀浆研磨离心,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,离心取上清后稀释5倍,之后按照测定步骤操作,使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.591-0.069=0.522,根据标准曲线 y=0.412x-0.0214x=1.319,按样本质量计算含量得:

LA含量(μmol/g质量)=1.1875×x÷W×稀释倍数=1.1875×1.319÷0.1×5=78.32μmol/g质量。

2. 100μL小鼠血清加入1mL提取液一,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,离心取上清,之后按照测定步骤操作,使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.572-0.211=0.361,根据标准曲线y=0.412x-0.0214x=0.928,按照液体体积计算含量得:

LA含量(μmol/mL=13.0625×x=13.0625×0.928=12.122μmol/mL

 

相关发表文献:

[1]  Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al.Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)

[2] Xiaojin Luo,Weihua ShiHaoming Yu,et al. Wearable Carbon Nanotube-Based BioSensors on Gloves for Lactate. Sensors. October 2018;(IF3.031)

[3] Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.

 

参考文献:

Eolbergrová J, MacMillan V, Siesjö B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cylasmic NADH/NAD+ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.

 

原创作者:上海尚宝生物科技有限公司

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