酸性转化酶(AI)活性检测试剂盒(可见分光光度法)
产品货号:BA1276 产品规格:50管/24样 产品简介: 蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶。根据适pH,将高等植物Ivr分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。AI(EC3.2.1.26)主要存在于细胞液泡或自由空间中,适pH为4.5~5.0(酸性),通过降解液泡中蔗糖,调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。 AI催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在540nm有特征光吸收,在一定范围内540nm光吸收增加速率与AI活性成正比。 注意:实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 产品组成: 试剂名称 规格 保存条件提取液 液体50mL×1瓶 4℃试剂一 液体60mL×1瓶 4℃试剂二 粉剂×1瓶 4℃试剂三 液体35mL×1瓶 4℃标准品 粉剂×1支 4℃溶液的配制: 1. 试剂二:临用加入30mL试剂一充分溶解备用;用不完的试剂4℃保存; 2. 标准品:10mg葡萄糖,临用加入1mL蒸馏水溶解,制备10mg/mL葡萄糖标准液备用。需自备的仪器和用品: 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。操作步骤: 一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 二、测定步骤 1. 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。 2. 标准品的制备:将标准液用蒸馏水稀释成 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL 葡萄糖标准液。3. 操作表:(在 1.5mLEP 管中依次加入下列试剂): 试剂名称(μL) 测定管 对照管 标准管样本 200 200 - 试剂一 - 800 - 试剂二 800 - 800 标准品 - - 200 混匀,37℃准确水浴 30min 后,煮沸 10min 左右(盖紧,以防水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变),12000g,4℃离心 5min,取上清。 上清 900 900 900 试剂三 500 500 500 混匀,煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,540nm 处记录各管吸光值A,ΔA=A测定-A 对照。 三、AI 活性计算 1. 标准曲线的建立: 以各浓度下吸光值减空白管(浓度为 0mg/mL)的吸光度为 y 轴,葡萄糖浓度为x 轴绘制标准曲线。根据标准曲线,将ΔA 带入方程得到 x(µmol/mL)。 2. AI 活性计算: (1)按样本蛋白浓度计算 单位的定义:37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。AI 活性(U/mg prot)=(x×V1×1000)÷(V1×Cpr)÷T=33.3×x÷Cpr (2)按样本质量计算 单位的定义:37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。AI 活性(U/g 质量)=(x×V1×1000)÷(W×V1÷V2)÷T=33.3×x÷W 1000:单位换算系数,1mg/mL =1000µg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.2mL;V2:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间:30min。注意事项: 1. 如果加入试剂三,煮沸 10min 后有混浊物出现,建议离心除去沉淀后,取上清测定吸光度;2. 如果吸光值大于 1,可以用蒸馏水将样本稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)。3. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。 实验实例: 1. 取0.1g黄花芯加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定=0.918,ΔA对照=0.752,ΔA=A测定-A对照=0.918-0.752=0.166,带入标准曲线y=1.3885x-0.1929,计算x=(0.166+0.1929)/1.3885=0.25848,按样本质量计算酶活得: AI活性(U/g质量)=33.3×x÷W=33.3×0.25848÷0.1=86.074 U/g质量。