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技术文章
植物总RNA快速提取试剂盒说明书
点击次数：35 发布时间：2023/3/24 14:25:29
植物总RNA快速提取试剂盒
产品货号：26125
产品规格：20T/50T
产品简介：
本试剂盒采用的方法改变传统一次性裂解的作法，对材料连续进行两次裂解，并确保RNA不被降解，有效地解离核蛋白与核酸的复合物。使用本试剂盒能在2h内完成RNA的提取工作，并得到质量较高的产品，通过琼脂糖凝胶电泳可以直观地看到，条带清晰，不拖尾。
本试剂盒可从植物组织(农作物、水果、花草)中，快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。提取的总RNA纯度高，基本没有基因组、蛋白和其它杂质的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT- PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游实验。
产品组成：
| 产品组成 | 20T | 50T | 保存条件 |
| 裂解液Ⅰ | 15ml | 37.5ml | 室温 |
| 裂解液Ⅱ | 12ml | 30ml | 室温 |
| 去蛋白液 | 13ml | 32.5ml | 室温 |
| 缓冲液 | 8ml | 20ml | 室温 |
| 提取液 | 15ml | 37.5ml | 室温 |
| 分离液 | 5ml | 12.5ml | 室温 |
| 洗涤液 | 12ml | 30ml | 室温 |
| RNase-Free ddH2O | 2ml | 5ml | 室温 |
| RNase-Free离心管 | 80个 | 200个 | 室温 |
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项：
1. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃) 会造成溶液沉淀， 影响使用效果，因此运 输和储存均在室温下(15-25℃)进行。
2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
预防RNase污染：
1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2. 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3. RNA在裂解液SL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
4. 配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(VNV)，混匀后放置过夜，高压灭菌。)
操作步骤 (仅供参考) ：
注：所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。
1. 取试验材料放入研钵加入液氮快速研磨成粉末状，分装于1.5ml新的无RNase离心管中，每管约加材料50-100mg。
2. 迅速加入600μl RNA裂解液Ⅰ。
3. 涡旋震荡混匀后再加入200μl分离液和200μl去蛋白液，振荡至混匀。
4. 冰上平放静置5min，4℃ 12000r/min离心10min。
5. 取约700μl上清液转入新的无RNase离心管后加入500μl RNA裂解液Ⅱ。
6. 振荡混匀后冰上平放静置5min，4℃ 12000r/min离心5min。
7. 取约700μl上清液转入新的无RNase离心管，加350μl缓冲液，摇晃混匀，再加入350μL去蛋白液，震荡混匀。
8. 4℃ 12000r/min离心10min。
9. 取约700μl上清液转入新的无RNase离心管并加入等体积的提取液，温和混匀后室温放置10min。
10. 4 ℃ 12000r/min离心10min，小心倒掉上清。
11. 加入500μl洗涤液，4℃ 12000r/min离心1min。
12. 小心倒掉上清，风干残留液体，加入30~50μl RNase-Free ddH2O溶解沉淀。
13. 得到RNA溶液并于-70 ℃保存。
RNA得率：
| 植物样本（100mg） | 总RNA量（μg） |
| 棉花叶片 | ~25 |
| 拟南芥种子 | ~40 |
| 香蕉果肉 | ~5 |
| 太子参块根 | ~15 |
RNA纯度及浓度检测：
完整性: RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA；植物RNA样品中zui大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度: OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7 .5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度: 取一定量的RNA提取物，用RNase-Free ddH2O稀释n倍，用RNase-FreeddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算。
终浓度(ng/μl) = (OD260)× (稀释倍数n)×40
注意事项：
1. 所有的离心步骤均在4摄氏度下进行，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
2. 需要自备研钵。
3. 裂解液Ⅰ和去蛋白液中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 关于DNA的微量残留：
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法wan quan避免DNA的微量残留 (DNase消化也无法做到10%无残留)，本公司的 RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时:
1)选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
原创作者：上海尚宝生物科技有限公司
