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α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性检测试剂盒（可见分光光度法）说明书
产品货号：BA1933
产品规格：50T/24S
产品简介：
α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化水解芳基或烃基与糖基之间的α-糖苷键 生成葡萄糖，不仅与细胞壁的松弛或加固有关，而且与细胞识别和一些信号分子产生密切相关。
α-GC分解对-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有zui大吸收峰，通过测定吸光值升高速 率来计算α-GC活性。
注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液 | 液体50mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂一 | 粉剂×2瓶 | -20℃ |
| 试剂二 | 液体25mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂三 | 液体80mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 标准品 | 液体1mL×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制：
1. 试剂一：临用取1瓶加10mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂-20℃保存4周，避免反复冻融。
2. 标准品：5μmol/mL的对硝基苯酚溶液。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每1000万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3，间隔10，重复30次），15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。
2. 组织的处理：称取约0.2g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。 液体样本：直接检测。若溶液有浑浊需离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2. 标准溶液的稀释：将 5μmol/mL的标准液用蒸馏水稀释成100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。
3. 标准液稀释可参考下表。
| 序号 | 稀释浓度（nmol/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（nmol/mL） |
| 1 | 5000 | 100 | 400 | 1000 |
| 2 | 1000 | 200 | 1800 | 100 |
| 3 | 100 | 1000 | 1000 | 50 |
| 4 | 50 | 1000 | 1000 | 25 |
| 5 | 25 | 1000 | 1000 | 12.5 |
| 6 | 12.5 | 1000 | 1000 | 6.25 |
| 7 | 6.25 | 0 | 1000 | 0（空白管） |
实验中每个标准管需500µL标准溶液。
4. 加样表：
| 试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
| 试剂一 | 400 | - | - |
| 试剂二 | 500 | 500 | - |
| 样本 | 100 | 100 | - |
| 充分混匀，放入37℃水浴锅/恒温培养箱中准确反应30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以bao证浓度不变） | |||
| 试剂一 | - | 400 | - |
| 充分混匀，8000g，4℃，离心5min，取上清液待测 | |||
| 上清液 | 500 | 500 | - |
| 标准液 | - | - | 500 |
| 试剂三 | 1000 | 1000 | 1000 |
| 充分混匀，室温静置2min后，于400nm处测定吸光值A，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、 A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管。ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。 标准曲线和空白管只需测1-2次。 | |||
三、α-GC活力计算
1. 标准曲线的建立：
根据标准管的浓度（x，nmol/mL）和吸光度（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA测定）代入公式计算样本产物浓度x（nmol/mL）。
2. α-GC活力计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GC活力（U/mg prot）=（x×V反总）÷（V样×Cpr）÷T=20x÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GC活力（U/g 质量）=（x×V反总）÷（W×V样÷V样总）÷T=20x÷W。
（3）按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α- GC活力（U/104 cell）=（x×V反总）÷（1000×V样÷V样总）÷T=0.02x
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需要另外测定；V反总：反应体系总体积，1mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；1000：细胞或细菌总数，1000万； T：反应时间，0.5h。
注意事项：提取液中含有使蛋白变性的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。
原创作者：北京优利保生物技术有限责任公司
