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技术文章
β-淀粉酶活性检测试剂盒 (碘-淀粉比色法) （微量法）使用说明书
点击次数：26 发布时间：2023/8/25 15:13:04
产品货号：BA1926 产品规格：100管/48样 产品简介： 淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。 碘可以与未被淀粉酶水解的淀粉结合，生成在570nm下有特征吸收峰的复合物，其深浅可计算出淀粉酶的活力单位。α-AL耐酸，β-AL不耐热。根据上述特性，钝化其中，就可测得另一种活性。 注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 产品组成： 试剂名称 规格 保存条件 试剂一 粉剂×1瓶 2-8℃ 试剂二 液体15mL×1瓶 2-8℃ 试剂三 液体30mL×1瓶 2-8℃ 标准品 粉剂×1瓶 2-8℃ 溶液的配制： 1. 试剂一：临用加入15mL试剂三，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂2-8℃保存8周； 2. 标准品：10mg淀粉标准品。临用加10mL试剂三，置沸水浴中振荡溶解，配成1mg/mL淀粉标准液。2-8℃保存四周。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1. 组织：称取约0.1g样本，加1mL蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取；6000g，常温离心10min，吸取上清液即为淀粉酶原液。 2. 液体：直接检测。（若有浑浊则离心后进行测定）。 二、测定步骤 1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节双波长至570nm，分光光度计蒸馏水调零。 2. 将淀粉标准液用蒸馏水稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液。 序号 稀释浓度（mg/mL） 标准液体积（µL） 蒸馏水体积（µL） 稀释后浓度（mg/mL） 1 1 200 300 0.4 2 0.4 200 200 0.2 3 0.2 200 200 0.1 4 0.1 200 200 0.05 5 0.05 200 200 0.025 6 0.025 200 200 0.0125 7 0.0125 200 200 0.00625 备注：实验中每个标准管需100µL标准溶液。 3. 按操作表依次加入各试剂： 试剂名称（µL） α-淀粉酶活力测定 总淀粉酶活力测定 空白管5 标准曲线的测定 测定管1 对照管2 测定管3 对照管4 标准管6 标准空白管7 样本 100 100 - - - - - 蒸馏水 - - - - 100 - 100 标准溶液 - - - - - 100 - 70℃水浴15min左右，冷却 样本 - - 100 100 - - - 试剂一 100 - 100 - 100 - - 蒸馏水 - 100 - 100 - 100 100 于40℃恒温水浴中准确保温5min 试剂二 50 50 50 50 50 50 50 混匀后吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中测定570nm下的吸光度，从左到右分别记为A1、A2、A3、A4、A5和A6，计算ΔAα=A5-（A1-A2），ΔA总=A5-（A3-A4），ΔA标准=A6-A7。空白管、标准曲线只需做1-2次。 三、β-淀粉酶活性计算 1. 标准曲线的绘制： 根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度 ΔA 标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。将ΔAα测定带入方程得到 x1（mg/mL），ΔA 总代入方程得到 x2（mg/mL）。 2. α-淀粉酶活性的计算 （1）按照样本质量计算 单位定义：每g组织每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活力单位。 α-淀粉酶活性(U/g 质量)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=0.2×x1÷W （2）按照蛋白质浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x1×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.2×x1÷Cpr （3）按液体体积计算： 单位定义：每mL液体每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(U/mL)= x1×V样÷V样÷T=0.2×x1 V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：样本总体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；T：反应时间，5min。 3. 总淀粉酶活性的计算 （1）按照样本质量计算 单位定义：每g组织每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活力单位。 总淀粉酶活性(U/g 质量)=x2×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=0.2×x2÷W （2）按照蛋白质浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。 总淀粉酶活性(U/mg prot)= x2×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.2×x2÷Cpr （3）按液体体积计算 单位定义：每mL液体每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。 总淀粉酶活性(U/mL)= x2×V样÷V样÷T=0.2×x2 V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：样本总体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；T：反应时间，5min。 4. β-淀粉酶活性的计算 （1）按照样本质量计算 单位定义：每g组织每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活力单位。 β-淀粉酶活性(U/g 质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.2×x2÷W-0.2×x1÷W （2）按照蛋白质浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。 β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.2×x2÷Cpr-0.2×x1÷Cpr （3）按液体体积计算 单位定义：每mL液体每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。 β-淀粉酶活性(U/mL)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.2×x2-0.2×x1 注意事项： 1. 吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8时，可以对样本进行适当稀释后测定。
原创作者：上海尚宝生物科技有限公司
