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技术文章
纤维素(CLL)含量检测试剂盒(微量法)说明书
点击次数:18 发布时间:2023/10/20 11:10:40
产品货号: BA2004 产品规格: 100T/96S 产品说明: 纤维素是由β-D-葡萄糖单元以β-1,4-糖苷键连接而成的直链多聚体,通常与半纤维素、果胶及木质素结合在一起,是植物细胞壁的主要结构成分。以纤维素为原料的产品广泛应用于食品、造纸、塑料、zha药、电工及科研器材等域。 纤维素在酸性条件下加热能分解成β-D-葡萄糖。在强酸作用条件下利用与蒽酮显色剂测定纤维素含量。 技术指标: di检出限:0.0037mg/mL 线性范围:0.00391-0.3mg/mL 注意:实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 产品组成: 试剂名称 规格 保存条件 提取液一 液体400mL×1瓶(自备) 2-8℃ 提取液二 液体100mL×1瓶 2-8℃ 试剂一 粉剂×2瓶 2-8℃ 试剂二 液体10mL×1瓶 2-8℃ 标准品 粉剂×1支 2-8℃ 溶液的配制: 1. 提取液一:80%乙醇400mL,即将320mL无水乙醇和80mL蒸馏水混合,自备。提供一个125mL空瓶。 2. 标准品:10mg葡萄糖。临用加入1mL蒸馏水溶解,配成10mg/mL葡萄糖溶液备用,2-8℃保存两周。 3. 工作液的配制:取一瓶试剂一中加入2.5mL试剂二,充分混匀,如较难溶解,可充分震荡或加热搅拌;用不完的试剂可以2-8℃保存一周。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、丙酮、 浓硫酸、无水乙醇、蒸馏水和EP管。 操作步骤(仅供参考): 一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 1. 细胞壁物质(CWM)的提取: (1) 称取约0.3g(记为W1)样本,加入1mL提取液一,室温快速匀浆,90℃水浴20min,冷却至室温,6000g,25℃离心10min,弃上清。 (2) 沉淀先后用1.5mL提取液一和丙酮各洗两遍(涡旋振荡2min左右,6000g,25℃离心10min,弃上清即可), 沉淀即为粗细胞壁。 (3) 在粗细胞壁中加入1mL提取液二(去除淀粉)浸泡15小时,6000g,25℃离心10min,弃上清,将沉淀用蒸馏水清洗两遍(涡旋振荡2min左右,6000g,25℃离心10min,弃上清即可),之后干燥沉淀(60-100℃均可),得到细胞壁物质(CWM),称重记为W2。 2. 纤维素的提取: (1) 称取烘干的CWM约5mg(记为W3),加入0.5mL蒸馏水充分匀浆,匀浆液转移至EP管中,用蒸馏水定容至0.5mL。 (2) 将定容后的匀浆液置于冰水混合物中,缓慢加入0.75mL浓硫酸,缓慢混匀,冰水浴中静置30min。8000g, 4℃离心10min,取上清液,用蒸馏水稀释20倍后待测。 注意:1. 若样本或者干燥后的沉淀质地坚硬,可以先研碎再进行后续步骤。 2. 在提取纤维素的过程中,先,置于冰水浴中的EP管需要固定,不要上下左右浮动,一方面保障自身安全,另一方面防止冰水混合物进入EP管造成试验误差;再者,加入浓硫酸时,建议枪头伸入样本液面以下,缓慢加入,防止液面沸腾及样本碳化。 二、测定步骤 1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至620nm,蒸馏水调零。 2. 将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078、0.0039mg/mL的标准溶液备用。 3. 标准品稀释表: 序号 稀释浓度(mg/mL) 标准液体积(µL) 蒸馏水体积(µL) 稀释后浓度(mg/mL) 1 10 100 950 1 2 1 50 350 0.125 3 0.125 200 200 0.0625 4 0.0625 200 200 0.03125 5 0.03125 200 200 0.015625 6 0.015625 200 200 0.0078 7 0.0078 200 200 0.0039 实验中每个标准管需150µL标准溶液。 4. 操作表(在1.5mL离心管中进行下列操作): 试剂名称(µL) 测定管 标准管 空白管 样本 150 - - 标准溶液 - 150 - 蒸馏水 - - 150 工作液 35 35 35 浓硫酸 315 315 315 混匀,置95℃水浴10min(盖紧,防止水分散失),取出后冷却至室温,吸取200μL于96孔板中或者微量玻璃比色皿中测定620nm处吸光值A,分别记为A测定管,A标准管,A空白管。计算ΔA=A测定管-A空白管,ΔA标准=A标准管-A空白管(空白管及标准曲线均只需检测1-2次)。 三、纤维素含量计算 1. 标准曲线的绘制: 根据标准管的浓度(x,mg/mL)和吸光度ΔA标准(y,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA(y,ΔA) 带入公式计算样本浓度(x,mg/mL)。 2. 纤维素含量的计算: (1)按样本质量计算 纤维素(mg/g 质量)=x×V提取×20×(W2÷W3)÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1 (2)按样本细胞壁物质(CWM)质量计算 纤维素(mg/g干重)=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52x÷W3 1.11:是此法测得葡萄糖含量换算为纤维素含量的常数,即111 µg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100µg纤维素蒽酮试剂所显示的颜色;V提取:纤维素提取液体积,1.25mL(0.5mL蒸馏水+0.75mL浓硫酸);20:样本稀释倍数;W1:样本质量,0.3g;W2:样本细胞壁物质(CWM)质量,g;W3,提取纤维素时称取的细胞壁物质(CWM)质量,g。 注意事项: 1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。 2. 浓硫酸具有强腐蚀性,操作时各个步骤均需特别注意:纤维素提取在加入浓硫酸时,建议枪头伸入样本液面以下,缓慢加入,以防止液体飞溅烧伤;95℃水浴结束取出后需冷却至室温再打开EP管盖,以防液体飞溅烧伤。 3. 由于试剂二挥发性强且具有刺激性气味,建议在通风橱中进行工作液的配制。 实验案例: 1. 取0.3g康乃馨叶片样本提取细胞壁物质(CWM)0.02g,称取烘干的CWM约5mg(记为W3),提取纤维素,取上清液,用蒸馏水稀释20倍后进行检测,用96孔板测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.538-0.061=0.477,标准曲线y=8.3536x+0.0388,计算x=0.05246,按样本质量计算得: 纤维素(mg/g 质量)=22.52×x×W2÷W3÷W1=15.752 mg/g 质量。 2. 取0.3g黑麦草样本提取细胞壁物质(CWM)0.04g,称取烘干的CWM约5mg(记为W3),提取纤维素,取上清液,用蒸馏水稀释20倍后进行检测,用96孔板测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.666-0.061=0.605,标准曲线y=8.3536x+0.0388,计算x=0.06778,按样本质量计算得: 纤维素(mg/g 质量)=22.52×x×W2÷W3÷W1=40.704 mg/g 质量。
原创作者:上海尚宝生物科技有限公司