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技术文章
乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒(微量法)使用说明书
点击次数:32 发布时间:2023/12/8 16:18:15
注意:正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。 产品货号:BA1261 产品规格:100管/48样 产品简介: LDH(EC 1.1.1.27)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是糖酵解途径的末端酶,催化丙酮酸与 乳酸之间的可逆反应,伴随着 NAD+/NADH 之间互变。 LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸进一步与 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中显棕红色,颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。 产品内容: 提取液:60mL×1瓶, 4℃保存; 试剂一:液体7 mL×1瓶, 4℃保存; 试剂二:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入1.3 mL双蒸水充分溶解备用,配好后-20 ℃保存,可保存两周,禁 止反复冻融; 试剂三:液体7 mL×1瓶,4℃保存; 试剂四:液体25mL×1瓶,4℃保存; 丙酮酸钠标准液:液体1mL×1支,4℃保存,2µmol/ml。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤: 一、粗酶液提取: 1、细菌、细胞或组织样品的制备: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 2、血清(浆)样品:直接检测。 3、丙酮酸钠标准液:取100µL标准液,倍比稀释至1、0.5、0.25、0.125、0µmol/mL,用2、1、0.5、0.25、0.125、0µmol/mL 做标准曲线。 二、测定操作: 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至450nm,蒸馏水调零。 2、样本测定 试剂名称(μL) 测定管 对照管 标准管 样本 10 10 - 标准液 - - 10 试剂一 50 50 50 试剂二 10 - - 蒸馏水 - 10 10 充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min 试剂三 50 50 50 充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min 试剂四 150 150 150 充分混匀,室温静置3min,取200µL转移至微量玻璃比色皿或在96孔板中,450nm下测定吸光度,计算∆A=A测定管-A对照管。每个测定管需要设一个对照。 根据标准管测定值和浓度做标准曲线,y为标准品浓度,µmol/mL;x为对吸光度(减去 浓度为0的标准管的OD值)。 三、LDH 活力单位计算: 1、计算样品丙酮酸的含量,即将∆A带入回归方程中(x),计算y值 2、血清(浆)LDH活力的计算 单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH(U/mL)=y×V样÷V样÷T×103=66.7×y 3、细胞、细菌和组织中LDH活力的计算 (1)按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH(U/mg prot)= y×V样÷(Cpr×V样)÷T×103=66.7×y÷Cpr 需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。 (2)按样本鲜重计算: 单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH(U/g鲜重)= y×V样÷(W÷V样总×V样)÷T×103=66.67×y÷W (3)按细菌或细胞密度计算: 单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH(U/104 cell)= y×V样÷(500÷V样总×V样)÷T×103=0.133×y V样:反应体系中加入的样本体积,10µL=0.01mL;V样总:加入的提取液体积,1mL;T:反应时间,15 min;Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;103:1µmol/mL=103nmol/mL。
原创作者:上海尚宝生物科技有限公司