其中，基于单分子定位的超分辨成像策略，使得定位、观察、研究单个探针分子独特的理、化、光学性能成为可能。偏振作为荧光信号的一个重要特性，近年来伴随着单分子三维取向成像技术的发展，逐步在单分子成像和超分辨域中展示出诸多新颖且重要的应用特性。

国家纳米科学中心中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室的赵睿航，卢晋团队总结了单分子三维取向超分辨成像技术的进展，介绍并分析了两类主要的单分子三维取向荧光显微技术——基于荧光吸收与辐射偏振调制的单分子三维取向成像方法以及利用点扩散函数工程将单个荧光分子的三维取向信息编码到荧光图像上的成像策略。

超分辨荧光成像技术概述

超分辨荧光成像技术主要分为三类。基于单分子定位的超分辨显微（SMLM）技术分辨率高，但成像时间长、时间分辨率差；结构光照明显微成像（SIM）技术成像速度快、光子利用率高、适用染料多，但分辨率有限；受激辐射损耗（STED）超分辨显微技术可提升分辨率，但存在光毒性和光漂白问题。此外，还有光子通量（MINFLUX）超分辨成像策略，具有较高定位精度和成像分辨率。

在生物研究中，生物大分子的微观结构和分子间相互作用变化在取向角度域有显著变化，单分子三维取向超分辨成像技术有助于深入阐释生命过程机制。

单分子三维取向成像技术

一、基于荧光吸收与辐射偏振调制的方法

1、技术原理

利用荧光分子吸收与辐射过程中偏振特性，通过在激发光路加入偏振调制模块，分析不同偏振方向激发光吸收效率及荧光发射信号偏振方向，获取单分子三维取向信息。如单分子荧光偏振（SMFP）技术，交替用平行和垂直偏振光激发样品，经偏振分光棱镜分路接收荧光信号，分析强度拟合取向和动力学信息。

SMFP技术成像示意图

2、研究案例

对肌动蛋白和S-DNA构象研究，通过荧光偏振显微技术测量取向变化，确定分子取向信息。

3、技术局限

线偏振激发调制要求单分子常亮且取向固定，与SMLM结合时需筛选常亮单分子，效率受限；仅对发射信号偏振分光成像虽便捷但难同时获取多未知参数，适用于有取向分布先验信息的样品。

二、基于PSF工程的方法

1、单分子三维取向对SMILM定位精度的影响及校正

单分子三维取向会使定位结果产生偏差，可通过设计“y-phi”掩模等方法消减偏差光子提升定位精度。

单分子三维取向对定位精度的影响与校正

2、高焦成像策略

离焦成像可展示单分子取向差异，但会增加PSF尺寸、降低信噪比和定位准确性；利用似然估计从单分子PSF图样获取取向信息，但对轴向分量不敏感。

3、傅里叶面调制策略

• CHIDO方法：使用双折射掩模编码PSF，通过应力工程光学器件产生双折射图案，经四分波片和沃拉斯顿棱镜分离成右旋圆（RHC）和左旋圆（LHC）PSF，可携带定位取向信息，对单分子三维取向和位置检测能力强。

单分子三维取向及CHIDO技术示意图

• Vortex PSF技术：在共轭后焦平面加入涡旋相位板获得 Vortex PSF，可确定分子三维位置、取向和摆动信息，精度高、信噪比高，形状对角和方位角敏感，可用于解析荧光探针与样品相互作用。

Vortex PSF成像示意图

4、基于傅里叶面调制的单分子显微成像系统性策略

以傅里叶光学为理论框架，将偶子信息编码到单分子荧光图像，如SMOLM技术可实现单分子三维取向与定位同时成像；后续研究不断发展该技术，如利用NR对磷脂膜成像揭示其对化学成分响应，将Vortex PSF应用于SMOLM对双层脂膜成像剖析生物样品结构特征，提出raPol显微镜及raMVR显微镜提高检测率和精度，实现对多种生物样品的成像研究。

利用SMOLM技术对磷脂膜微区超分辨成像

基于偏振涡旋PSF的SMOLM成像原理图

raPol显微镜

raMVR显微镜

应用于活细胞或单颗粒的超分辨取向成像技术

1、超分辨偶取向映射（SDOM）方法

通过调制偏振激发光解析荧光偶子取向，亚衍射限分辨率，成像速度快，适用于活细胞成像。

2、偏振SIM（pSIM）技术

结合荧光偏振调制和结构光照明技术，可解析生物分子取向与结构信息，与三维SIM结合实现快速偏振三维SIM（polar-3DSIM）成像。

3、光谱和偏振光学层析成像（SPOT）技术

从荧光强度、光谱和偏振三个维度解析膜信息，用于活细胞亚细胞尺度脂质组学研究，可实时监测细胞活动。

4、单分子荧光偏振显微镜在单颗粒催化成像中的应用

用于纳米限域效应的单分子三维取向研究，解释了纳米催化剂上的催化活性现象。

总结与展望

单分子三维取向成像技术在解析生物样品纳米尺度结构与有序度、生物大分子构象等方面具备独特优势，但其广泛应用面临诸多挑战。

在荧光标记策略上，现有方式难以确保荧光探针与生物大分子取向关系，如基于不同原理的 SMOLM 技术均存在各自问题；在单分子荧光亮度或成像信噪比方面，成像策略会降低信噪比，但已有优化筛选荧光探针提升信噪比的尝试；活细胞成像受多种因素影响困难重重，虽可借鉴相关方案且深度学习提供新思路，但复杂微环境仍增加了解析难度；多色成像或波长维度拓展是应用于复杂生命过程研究的趋势。

不过，随着技术发展，该技术在提升成像推进应用广度和深度等方面景依然广阔。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：赵睿航, 卢晋. 单分子三维取向超分辨成像技术进展（特邀）[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(6): 0618015. Ruihang Zhao, Jin Lu. Three-Dimensional Orientation ａnd Localization Microscopy of Single Molecules Using Super-Resolution Imaging Technology (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618015.

原创作者：罗辑技术（武汉）有限公司