相较于传统的落射荧光显微技术，光片显微镜通过选择性逐层照明生物样本，大大提高了光子利用效率，降低了光毒性，并显著提升了成像速度。光片显微镜问世以来，其在生命科学研究中的应用范围逐渐拓宽，从胚胎学、神经科学到肿瘤研究等多个域均有所涉及，不仅可用于观察细胞和组织的基本结构，还可用于实时监测生物过程中的动态变化。同时，其跨尺度的特点使其适用于从宏观到微观的多个尺度上的观察。

华中科技大学周瑶、费鹏团队发表文章综述了光片显微镜在高通量成像、超分辨成像以及易用性方面的应用及发展，旨在为生命科学研究人员提供了解和参考，推动光片显微镜在更多域的应用和发展。

光片显微镜在高通量成像中的应用及发展

一、面临的挑战

在脑科学研究和肿瘤病理学诊断中，对大样本进行三维显微成像至关重要，但传统共聚焦显微镜通量有限，处理大型样本时图像采集时间长，且提升分辨率会降低信噪比。光片显微镜虽有优势，但高斯光片显微镜存在视野与光片厚度的矛盾，难以平衡大视野照明探测和微米三维分辨率。

二、技术改进与发展

1、轴向扫描技术

2015年，Dean等提出使用音圈电机、电动可调谐透镜等电动部件沿传播方向扫描高斯光片，配合科研CMOS相机电子卷帘狭缝扫描，扩大了瑞利范围，提高了成像通量，但对激发光功率要求高且会造成额外光漂白。以mesoSPIM和ctASLM为代表，将此项技术应用于大组织成像取得了成果。

2、平铺拼接光片技术

2015年，Gao等开发了平铺拼接光片荧光显微技术，利用铁电液晶空间光调制器控制光片移动，拍摄小视场高分辨图像后拼接，实现大视场高轴向分辨率成像，但同步扫描方式存在光漂白等问题。

3、贝塞尔光片技术

贝塞尔光片是实现大样本三维高通量成像的利器，其具有较强自愈性和抗散射能力，干涉可用范围优于高斯光片。2010年，Fahrbach等提出将无衍射的贝塞尔光束与光片技术结合的思想，发明了自愈光束显微技术，但贝塞尔光片旁瓣影响轴向分辨率。中国科学院西安光学精密机械研究所姚保利研究员团队和华中科技大学费鹏教授团队分别采用不同方法抑制旁瓣，实现了对小鼠大脑的高通量三维成像。2020年，Zhao等将深度神经网络与光片显微镜结合提升了分辨率，2021年，Fang等将扫描贝塞尔光片显微镜与内容感知压缩传感计算方法结合，大幅提升了分辨率和光学通量。

光片显微镜在高通量成像中的发展

光片显微镜在超分辨成像中的应用及发展

一、超分辨技术原理及局限

光学显微镜受衍射限限制，超分辨显微成像技术虽提高了空间分辨率，但在时间分辨率及光毒性方面存在问题，限制了对生物结构的精细三维长时程观察。超分辨荧光显微镜根据成像原理分为基于频谱调制、光激活、抑制点扩散函数边缘、荧光涨落原理等类型。

二、光片显微镜与超分辨技术结合的成果

1、选择性照明结合结构光照明显微镜

2014年，Chen等提出晶格光片荧光显微（LLSFM）技术，将结构光照明与光片显微成像技术结合，实现了150nm超分辨率成像，但光晶格无法多角度旋转，只能在横平面一个方向实现超分辨。2017年，Chang等提出相干结构照明光片荧光显微技术（csiLSFM），通过改变光束传播方向旋转条纹结构光光场，在横平面各方向实现超分辨，将空间分辨率提高到100nm，但结构光照明提高分辨率倍数有限。

2、选择性照明结合单分子定位显微镜

2011年，Zanacchi等将单分子定位超分辨技术引入光片荧光显微成像，提高了图像信噪比，在厚散射样本中实现单分子纳米定位和三维活细胞超分辨成像，分辨率达60nm。2019 年，Kim等提出单分子斜平面超分辨显微镜（obSTORM），扩大了单分子定位系统轴向范围，展示了多种样本深度达66μm 的超分辨率成像。

3、选择性照明结合STED显微镜

2011年，Friedrich等将选择平面显微技术与STED相结合，发挥了STED成像速度快和光片显微成像深度深、光强低的优点，提高了轴向分辨率，实现对厚活体生物快速高分辨成像，打破了STED只能用于组织表面成像的限制。

4、选择性照明结合计算超分辨成像

2016年，Chen等提出双光子超分辨率光片成像（2PLS-SOFI），基于波动/闪烁探针的非线性激励开发了相关显微镜，提高了空间和时间分辨率。2020年，Chen等改进贝叶斯超分辨技术，提高了数据处理速度。2022年，Zhao等提出渐进式深度学习超分辨率策略与双环调制选择性平面照明显微镜设计结合，以100nm各向同性空间分辨率可视化活细胞内结构动态数小时，揭示了细胞内结构关系和相互作用。

光片显微镜在超分辨成像中的应用

光片显微镜在易用性方面的发展

一、早期结构限制

早期光片成像系统照明与探测光路垂直，双物镜限制了样本类型和应用。在许多应用中，传统光片系统因样本夹持或生物体结构遮挡无法从正交方向成像，且在微流控芯片、玻片和96孔板中样本大规模成像受限。对于高倍率成像，物镜工作距离短，传统样本承载方式难以实现成像，且样本数量规模难以提升。

光片显微镜的典型模态

二、改进措施及成果

1、斜置开顶式光片技术

2015年，Huang等使用特定物镜组合与倾斜玻片构成样品腔，补偿像差，实现了对微流控通道和96孔板中多种生物样本的高通量成像。Jonathan课题组对倒置开顶式光片系统进行一系列技术改进，包括设计SIL拓展应用、用SIMlens代替SIL校正像差、提出紧凑型可变分辨率倒置开顶式显微镜并证明其实用性。

2、单物镜光片显微成像技术

2008年，Dunsby提出斜平面显微镜（OPM），采用离轴激发和远程聚焦技术，单物镜负责光片激发和荧光信号采集。2015年，Bouchard等提出扫描、共焦对齐平面激发（SCAPE）显微镜，实现多类样本快速、温和、高分辨率三维活体成像，但远程成像模块导致成像性能损失。2019年，Yang等将远程聚焦物镜换为水镜提升收光能力，2022年，Yang等提出DaXi技术，使用定制高质量高数值孔径远程聚焦物镜，实现几乎不损失分辨率的三维高速成像。然而，单物镜光片显微镜存在数值孔径、像差、倍率切换等问题，目更适用于单一高倍率系统。

总结与展望

单物镜光片显微镜虽在兼容性上有所拓展，但仍存在不少缺陷。大视野成像时，受技术原理与结构限制，面临诸多难题，如光线传播与光场分布不均，致使难以获取大视野清晰图像。其像差校正为复杂，照明与探测光路斜交产生像差，现用三物镜远程聚焦法虽能校正，但系统复杂、成本高、稳定性低且易受环境影响，对业人员依赖度高。倍率切换也困难重重，远程聚焦使探测光路复杂，物镜光学参数受限，无法像共聚焦显微镜那样原位自由变倍，严重影响研究效率。因此，目在中低倍情况下分辨率较差，无法满足多种研究需求。

展望未来，期待新型直接探测光片显微成像系统。它要大幅提升探测分辨率，现样本细节；提高荧光收集效率，增强成像灵敏度与对比度；解决倍率切换问题，实现便捷原位变倍，兼具良好成像性能；达成对多种样本高通量、高分辨、智能化三维成像分析，涵盖单细胞到大型组织。若能实现，光片显微镜将融合高性能、通用性与易用性，成为下一代荧光显微成像关键技术，有力推动多域发展。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：周瑶, 费鹏. 光片荧光显微成像技术的发展及应用（特邀）[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(6): 0618019. Yao Zhou, Peng Fei. Development ａnd Application of Light Sheet Fluorescence Microscopy Technology (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618019.

原创作者：罗辑技术（武汉）有限公司