引物的特异性：

引物长度：一般在 18-30 碱基之间，常用为 20bp 左右。过短则特异性低，过长则可能会引起引物间的退火而影响有效扩增。

避免内部二级结构：避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。

G/C 和 A/T 碱基均匀分布：G/C 含量在 40%-60% 之间为宜，且引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。

避免两个引物间特别是 3' 末端 DNA 序列互补：以及同一引物自身 3' 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。

引物 3' 端碱基与模板严格配对：并且 3' 端为 G、C 或 T 时引发效率较高。

引物 5' 端碱基可不与模板匹配：可添加与模板无关的序列，如限制性内切酶的识别位点、ATG 起始密码子或启动子序列等。这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循环中将被带到双链 DNA 中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因两侧又有了的限制酶切位点，用相应的限制酶切割后即可将 PCR 产物定向克隆到载体中。

引物的 Tm 值：

Tm 值的范围：一般在 55-65℃之间，GC 含量在 40%-60%。

上下游引物的 Tm 值差异：一对引物的 Tm 值应该相似，差异在 1℃以内，*多不超过 5℃。

退火温度：退火温度需要比解链温度低 5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使 PCR 的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。一对引物的退火温度相差 4℃-6℃不会影响 PCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在 55℃-75℃间变化。

引物的浓度：每条引物的浓度 0.1-1umol 或 10-100pmol，以引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

避免扩增模板的二级结构区域：选择扩增片段时避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。

与靶 DNA 的错配：当被扩增的靶 DNA 序列较大的时候，一个引物就有可能与靶 DNA 的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用 BLAST 软件进行检测，选择 Align Two Sequences (Bl2Seq)。将引物序列粘贴到 1 区，将靶 DNA 序列粘贴到 2 区，这两者可以互换的，并且 BLAST 会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的 GI 号也可以直接输入 GI 号，这样就不用粘贴一大段的序列了。*后在 3 处点击 Align 就可以查看引物在靶 DNA 中是否有多个同源位点了。

引物末端：

3' 端：不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3' 端不能发生错配。如扩增编码区域，引物 3' 端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。使用兼并引物时，要参考密码子使用表，注意生物的偏好性，不要在 3' 端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度 (1uM-3uM)。

5' 端：对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5' 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、Eu3 + 等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的让步。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物 5' 端而不影响特异性。当计算引物 Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

其他：

避免 3' 端 8bp 及以上序列与模板多位点互补：尽量避免上下游 3' 端 4bp 及以上反向互补，尽量避免内部回文。

扩增产物的单链不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于 58.6kJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2'- 脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。

引物应具有特异性：引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。如果实在满足不了这么多要求，那么就保证引物与模板配对好、两个引物退火温度差不多、每个引物的 GC 含量不要太高或太低、引物没有回文序列即可。如果还是满足不了，只要保证前两点就够了。

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