总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒/微量法注意事项正式测定之选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液,细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。
在酸性环境下,物质还原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了其总抗氧化能力。
自备实验用品:
可见分光光度计、恒温水浴锅、低温离心机、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 60mL×1 瓶,使用预冷。
试剂一:液体 50mL×1 瓶,避光保存。
试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体 5mL×1 瓶,避光保存。
样品的制备:
(1) 血清、血浆、唾液或尿液样品
血浆(制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝,不宜使用 EDTA 抗凝)4℃,5000rpm 离心 10min,取上清待测。血清、唾液或尿液样品直接用于测定,也可以-80℃冻存(不宜超过 30 d)后再测定。
(2) 组织样品
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
(3) 细胞样品
按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒/微量法
操作步骤:
混合液(现配现用):将试剂一、试剂二、试剂三按 10:1:1 的比例混合,使用预温至 37℃。
空白管测定管
混合液(μL)900900
样品(μL)30
双蒸水(μL)12090
充分混匀,反应 20min,双蒸水调零,1mL 玻璃比色皿,测定 593nm 处吸光值,△A= A 测定-A 空白注意:空白管只需测定一次。
总抗氧化能力计算:
1. 定义:样品的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值(△A)所需的标准液离子浓度表示。
标准曲线:y=0.8442x-0.0048,R2=0.9979
2. 计算公式:
(1) 按蛋白浓度计算
单位定义:每 mg 蛋白每分钟产生 1μmolFe2+-TPTZ 定义为一个酶活力单位。总抗氧化能力(U/mg prot)=(△A+0.0048)÷0.8442×1000×V 样÷(V 样×Cpr)÷T
=59.228×(△A+0.0048)÷Cpr
(2) 按样品质量计算
单位定义:每 g 样本每分钟产生 1μmolFe2+-TPTZ 定义为一个酶活力单位。
总抗氧化能力(U/g 鲜重)=(△A+0.0048)÷ 0.8442×1000×V 样÷(V 样÷V 样总×W)÷T=59.228×(△A+0.0048)÷W
(3) 按细胞数量计算
单位定义:每万个细胞每分钟产生 1μmolFe2+-TPTZ 定义为一个酶活力单位。、
总抗氧化能力(U/104cell)=(△A+0.0048)÷0.8442×1000×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个))÷T =59.228×(△A+0.0048)÷ 细胞数量(万个)
(4) 按液体体积计算
单位定义:每毫升样本每分钟产生 1μmolFe2+-TPTZ 定义为一个酶活力单位。
总抗氧化能力(U/mL)=(△A+0.0048)÷0.8442×1000÷T= 59.228×(△A+0.0048)
V样总:加入提取液体积,1 mL; V 样:反应中样品体积,0.03mL;T:反应时间,20min;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL
注意事项:
1. 试剂二对人体有刺激性,请采取适当的防护措施。为了您的安全和健康,请穿实验服并戴乳胶手套操作。
2. 尽量避免使用在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂,否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
3. 样品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢剂和 DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。