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亚硝酸还原酶(NiR)检测试剂盒/微量法
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品牌名称：通蔚生物(进口品牌)型号：100T/48S 原产地：中国大陆 发布时间：2023/8/1 16:05:30更新时间：2024/12/16 15:27:04
产品摘要：亚硝酸还原酶(NiR)检测试剂盒/微量法是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
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详细内容
亚硝酸还原酶(NiR)检测试剂盒/微量法
注意事项
正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少，即540nm处吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。
需自备的仪器和用品：
天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。
天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。
试剂的组成和配制：
提取液：液体112mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用加5mL蒸馏水溶解。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）
试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
工作液：临用根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。
酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3，间隔7，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。
亚硝酸还原酶(NiR)检测试剂盒/微量法
测定操作表：
|
| 空白管 | 对照管 | 测定管 |
| 样本（μL） |
| 20 | 20 |
| 蒸馏水（μL） | 20 | 40 |
|
| 试剂一（μL） | 40 |
| 40 |
| 试剂二（μL） | 40 | 40 | 40 |
| 混匀后，25℃反应1h | |||
| 试剂三（μL） | 40 | 40 | 40 |
| 充分震荡30S | |||
| 上清液（μL） | 70 | 70 | 70 |
| 工作液（μL） | 140 | 140 | 140 |
| 充分混匀，，静置3min后测定各管540nm处吸光值，分别记为A空白管、A对照管、A测定管。空白管只要做一管，每个测定管需设一个对照管。 | |||
计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。
1．按照蛋白含量计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（V样×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（W ×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷细胞数量
V标：标准液体积，0.04mL；V样：体系中加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.6797x + 0.0072，R2 = 0.9997；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。
1．按照蛋白含量计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷（V样×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷（W ×V样÷V样总）÷T = 2.94×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T = 2.94×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷ 细胞数量
V标：标准液体积，0.04mL；V样：体系中加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g
注意事项：
1. 配制好的工作液3天内使用完。
2. 若吸光值超过1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。
4. 标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
5. A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-1.5。
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