谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)检测试剂盒/微量法注意事项正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
GOT( 2.6.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化可逆转氨基反应,是氨基酸代谢的重要酶。此外,GOT在心肌细胞中含量高,临床上一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。肝脏损害时其血清浓度也可升高。
GOT催化 α-同戊二酸和天门冬氨酸发生转氨基反应,生成谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙酮酸;丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显棕红色;测定505nm吸光度的变化,即可计算GOT酶活力。
需自备的仪器和用品:
可见分光光计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体2.5 mL×1瓶, 4℃保存;
试剂二:液体2.5 mL×1瓶, 4℃保存;
试剂三:液体25 mL×1瓶,4℃保存;
样品测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)检测试剂盒/微量法
测定操作表:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
2、在EP管或在96孔板中加入下列试剂
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
待测样本 | 10 | |
煮沸10min的待测样本 | | 10 |
试剂一 | 25 | |
蒸馏水 | | 25 |
混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应20min
混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应20min
混匀,室温(25℃)放置10min,505nm波长处测各管吸光度A。ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。
计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归曲线, y = 0.4768x-0.0013 (x为标准品浓度,umol/mL;y为ΔA)。
2、血清(浆)GOT活力的计算
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0013)÷0.4768÷T×103=104.9×(ΔA+0.0013)
3、细胞、细菌和组织中GOT活力的计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0013)÷0.4786×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =104.9×(ΔA+0.0013)÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0013)÷0.4768×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =104.9×(ΔA+0.0013)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0013)÷0.4768×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.21×(ΔA+0.0013)
V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V2:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,20min;Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下:
1、标准条件下测定的回归曲线, y = 0.2384x-0.0013 (x为标准品浓度,umol/mL;y为ΔA)。
2、血清(浆)GOT活力的计算
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0013)÷0.2384÷T×103=209.7×(ΔA+0.0013)
3、细胞、细菌和组织中GOT活力的计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0013)÷0.2384×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =209.7×(ΔA+0.0013)÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0013)÷0.2384×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =209.7×(ΔA+0.0013)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT(nmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0013)÷0.2384×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.419×(ΔA+0.0013)
V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V2:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,20 min;Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
1、标准曲线线性范围为:0.01 umol/mL -2 umol/mL。
2、ΔA线性范围为:0.01 -1。