土壤酸性磷酸酶(S-ACP)检测试剂盒/微量法注意事项正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶,其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性,是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响,根据适pH范围,通常分为酸性、中性和碱性三种类型。
酸性环境中,S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠,通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。用加100mL蒸馏水充分溶解。
试剂三:液体×1瓶,4℃保存。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用加576 μL无水乙醇(自备),24 μL蒸馏水充分溶解。(变褐色后不能再使用)
标准品:液体×1瓶,0.5μmol/mL苯酚标准液,4℃保存。
粗酶液提取:
称取风干混匀土壤约0.1g,加入50μL甲苯(自备),轻摇15min;加0.4 mL试剂一并且摇匀后,置于37℃恒温培养箱,开始计时,催化反应24h;到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀,以终止酶催化的反应。8000g,25℃离心10min,取上清液置于冰上待测。
土壤酸性磷酸酶(S-ACP)检测试剂盒/微量法
测定步骤:
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上,调节波长到660 nm,蒸馏水调零。
2. 空白管:取微量玻璃比色皿/酶标板,加入10μL蒸馏水,20μL试剂三,4μL试剂四,充分混匀,显色后再加蒸馏水166μL,混匀后25℃静置30 min,于660 nm测定吸光度,记为A空白管。
3. 标准管:取微量玻璃比色皿/酶标板,加入10μL标准液,20μL试剂三,4μL试剂四,充分混匀,显色后再加蒸馏水166μL,混匀后25℃静置30 min,于660 nm测定吸光度,记为A标准管。
4. 测定管:取微量玻璃比色皿/酶标板,加入10μL上清液,20μL试剂三,4μL试剂四,充分混匀,显色后再加蒸馏水166μL,混匀后25℃静置30 min,于660 nm测定吸光度,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。
S-ACP活性计算公式:
活性单位定义:37℃中每克土壤每天释放1μmol酚为1个酶活单位。
S-ACP(μmol/d /g 土样)=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W÷T =0.725×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准液:0.5 μmol/mL; V总:催化体系总体积,1.45mL;W:土壤样品质量,g;T:催化反应时间,24h=1 d。