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HiPURE高纯度质粒小提试剂盒
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品牌名称:$brandModel.Title(进口品牌)型号: 原产地:中国大陆 发布时间:2024/10/29 15:55:57更新时间:2024/10/29 15:55:57
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详细内容
HiPURE高纯度质粒小提试剂盒
本试剂盒用于高纯度质粒DNA的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理,质 粒可从菌体中释放出来,并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除 杂质,在低盐、高pH条件下洗脱,得到纯度较高的质粒 DNA 。使用本试剂盒每次 可处理 1-5 ml 过夜培养的菌液,所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR 、测序及转染等 各种分子生物学实验。
它具有下列特点:
1. 快捷、高效:操作简便,得率高,节约时间。
2. 纯度高:沉淀致密,去杂干净。
保存条件
在室温(15-25℃)干燥条件下,可保存 12 个月;更长时间的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液产生沉淀,应在使用前置于 37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1 应置于 2-8℃ 保存,可稳定保存 6 个月。
柱平衡:
向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入400μl 的平衡液BL ,12,000 rpm (-13,400×g ) 离 心 1 min ,弃收集管中滤液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
1. 取 1-5 ml 过夜培养的菌液,室温 12,000 rpm 离心 1 min ,尽量将上清去除干净。
(注 意:根据菌液的浓度决定取液量,浓度高时取 1.5 ml 菌液离心即可,浓度低时可多收集一次)
2. 加入 250 μl Buffer S1 ,旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
(注 意:菌体沉淀一定要悬浮均匀,如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解,导致提取的质粒浓度及纯度降低)
3. 加入 250 μl Buffer S2 ,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直到溶液变成清亮、粘稠。
(注 意:不可剧烈震荡, 以免造成基因组的污染,所用时间不要超过5 min , 以免质粒受到破坏,如未完全变得清亮,可能是菌体太多,可增加Buffer S2的用量,在后续的操作中 Buffer S3 的用量也要相应增加)
4. 加入350μl Buffer S3 ,立即颠倒混匀6-8次,可见白色沉淀物产生,室温静置 2 min, 然后12,000 rpm 离心 5 min。
(注 意:Buffer S3 加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀)
5. 小心将上清液转移到离心吸附柱中,12,000 rpm 离心 0.5 min ,弃收集管中滤液。
6. 可选步骤:向吸附柱中加入 500 μl Buffer W1 ,12,000 rpm离心0.5 min ,弃收集管中滤液。
(注 意:Buffer W1 为浓缩液,按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖, 以防酒精挥发。如果宿主菌是endA- ,如DH5α或0 ,此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+ ,如 TG1 、BL21 、HB101、 JM101等,此步骤不可省略,因这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也 推荐采用此步骤)
7. 加入 600 μl Buffer W2 ,室温 12,000 rpm 离心 0.5 min ,弃收集管中滤液。
(注 意:Buffer W2为浓缩液,按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖, 以防酒精挥发)
8. 加入 500 μl Buffer W2 ,室温12,000 rpm 离心0.5 min ,弃收集管中滤液。
9. 干燥。将离心吸附柱于12,000 rpm 离心 2 min ,甩干残留漂洗液。
(注 意:此步不能省略,否则残留乙醇会影响质粒的后续使用)
10. 将吸附柱置于一新的无菌 1.5 ml 离心管(自备)中,加入 50-100 μl 的洗脱液 Buffer EB, 室温放置 2 min ,12,000 rpm 离心 1 min ,离心管底溶液即质粒 DNA。
(注 意:为增加洗脱效率,可将洗脱液在60℃预热。如需使用去离子水洗脱,可用NaOH 调整其pH值在 7.0 - 8.5之间,为了增加质粒回收率,可将得到的溶液重新加入到离心管中,室温放置 2 min, 再次离心收集)
HiPURE高纯度质粒小提试剂盒
低拷贝或大质粒(>10 kb)提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10 kb 的大质粒,应加大菌体使用量,使用 5-10 ml 过夜培养物,同时按照比例增加 Buffer S1 、S2 、S3 的用量,洗脱液 Buffer EB 应在 60℃ 水浴预热,在吸附和洗脱时可以适当延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。
1. 细菌培养时间一般为12-16小时,如接种量大则应减少培养时间,过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒DNA突变。
2. 每次使用时都要注意 Buffer S2 和 S3 是否形成沉淀,如有沉淀 37℃溶解后再用。
3. 注意Buffer S1,S2 和 S3的用量比例,若细菌量增大,需按比例放大这些溶液使用量。
4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关,一般 1.5 ml 过 夜培养菌体可收获约10 μg 高拷贝质粒。