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MaxEndoFree无内毒素质粒小提中量试剂盒
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详细内容
MaxEndoFree无内毒素质粒小提中量试剂盒
本试剂盒适用于无内毒素质粒 DNA 的小提中量制备。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理,质粒可从菌体中释放出来,并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。再经内毒素清除液清洗,可将绝大多数菌体内毒素清除干净,然后通过清洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质,*后在低盐、高 pH 条件下洗脱得到高纯度无内毒素的质粒DNA。使用本试剂盒可从5 - 15 ml 过夜培养的菌液中纯化得到高达70μg 的无内毒素质粒DNA,所得质粒除可用于常规分子生物学实验外,还适合细胞株的转染实验。
它具有下列特点:
1. 快捷、高效:操作简便,得率高,节约时间;
2. 纯度高:沉淀致密,去杂干净;
3. 内毒素去除简单:柱上去除内毒素,方便快速,清除干净。
保存条件
在室温(15-25℃)干燥条件下,可保存 12 个月;更长时间的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液产生沉淀,应在使用前置于37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1 应置于 2-8℃ 保存,可稳定保存 6 个月。
柱平衡:向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入 400 μl 的平衡液 BL,12,000 rpm(-13,400×g) 离心 1 min,弃收集管中滤液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
1. 取 5 - 15 ml 过夜培养的菌液,室温 12,000 rpm 离心 1 min,尽量将上清去除干净。(注 意:根据菌液的浓度决定取液量,浓度高时取 5 ml 菌液离心即可)
2. 加入 500 μl Buffer S1,旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
(注 意:菌体沉淀一定要悬浮均匀,如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解,导致提取的质粒浓度及纯度降低)
3. 加入 500 μl Buffer S2,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直到溶液变成清亮、粘稠。
(注 意:不可剧烈震荡,以免造成基因组 DNA 片段的污染,所用时间不要超过5 min,以免质粒受到破坏)
4. 加入 500 μl Buffer S4,立即颠倒混匀 6-10 次,此时会出现大量漂浮物,12,000rpm离心 10-20 min。
(注 意:Buffer S4 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如果离心后上清液中仍有漂浮物,可增加离心时间,转移液体时可轻轻倒入,如果有少量漂浮物倒出,不影响后续实验)5. 小心将上清液转移到一新的离心管中,加入 0.3 倍异丙醇,混匀,将混合液加入离心吸附柱中,12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中滤液。
(注 意:吸附柱一次只能转移 750 μl 液体,剩余液体分次转入)
6. 向吸附柱中加入 500 μl ToxinOut Buffer,室温静置 5 min,12,000 rpm离心1 min,弃收集管中滤液。
7. 加入 600 μl Buffer W2,室温 12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中滤液。
MaxEndoFree无内毒素质粒小提中量试剂盒
(注 意:Buffer W2为浓缩液,要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防酒精挥发)
8. 加入 500 μl Buffer W2,室温 12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中滤液。
9. 干燥。将离心吸附柱于 12,000 rpm 离心 2 min,甩干残留漂洗液。
(注 意:此步不能省略,否则残留乙醇会影响质粒的后续使用)
10. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 ml 塑料离心管(自备)中,加入100 - 300 μl 的洗脱液 Buffer EB,室温放置 2 min。12,000 rpm 离心 1 min,离心管底溶液即质粒DNA。
(注 意:为增加洗脱效率,可将洗脱液在 60℃预热。如需使用去离子水洗脱,可用NaOH调整其pH值在 7.0 - 8.5 之间,为了增加质粒回收率,可将得到的溶液重新加入到离心管中,室温放置2 min,再次离心收集)
1. 细菌培养时间一般为 12 - 16 小时,如接种量大则应减少培养时间,过度培养会降低质 粒质量甚至导致质粒 DNA 突变。
2. 每次使用时都要注意 Buffer S2 和 S4 是否形成沉淀,如有沉淀37℃溶解后再用。
3. 注意溶液 S1,S2 和 S4 的用量比例,若细菌量增大,需按比例放大这些溶液的使用量。
4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。