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MagPURE磁珠法质粒小提试剂盒
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详细内容
MagPURE磁珠法质粒小提试剂盒
本试剂盒适用于磁珠法质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理,质粒可从菌体中释放出来,并特异、高效地被磁珠吸附。再经蛋白清除液清洗,可将绝大多数菌体蛋白清除干净,然后通过清洗液的清洗可去除盐离子及其他杂质,*后在低盐、高 pH 条件下洗脱得到高纯度的质粒 DNA。使用本试剂盒可从1 - 5 ml 过夜培养的菌液中纯化得到高达 30 μg 的质粒 DNA,所得质粒可用于常规分子生物学实验。
它具有下列特点:
1. 快捷、高效:操作简便,得率高,节约时间;
2. 纯度高:沉淀致密,去杂干净;
3. 磁珠法操作,可用于自动化提取。
保存条件
在室温(15 - 25℃)干燥条件下,可保存 12 个月;更长时间的保存可置于2 - 8℃。加入 RNase A 后的 Buffer S1 应置于 2 - 8℃保存,可稳定保存6 个月。
1. 取 1 - 5 ml 过夜培养的菌液,室温 12,000 rpm 离心 1 min,尽量将上清去除干净。(注 意:根据菌液的浓度决定取液量,浓度高时取 1.5 ml 菌液离心即可,浓度低时可多收集一次)
2. 加入 250 μl Buffer S1,旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
(注 意:菌体沉淀一定要悬浮均匀,如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解,导致提取的质粒浓度及纯度降低)
3. 加入 250 μl Buffer S2,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直到溶液变成清亮、粘稠。
(注 意:不可剧烈震荡,以免造成基因组 DNA 片段的污染,所用时间不要超过5 min,以免质粒受到破坏)
4. 加入 350 μl Buffer S4,立即颠倒混匀 6-8 次,12,000 rpm 离心5-10 min,小心将上清液转移到一干净的离心管中。
(注 意:Buffer S4 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀;离心后如上清还有漂浮物可延长离心时间)
5. 加入 0.5 倍异丙醇混匀,然后再加入 20 μl Magnetic Bead(磁珠),震荡混匀5min。(注 意:吸取磁珠时一定要混匀后再取)6. 将离心管置于磁力架上静置 1 min,磁珠完全吸附后,吸去液体。
7. 将离心管从磁力架上取下,加 500 μl Buffer W1,旋涡充分混匀30 s。
(注 意:Buffer W1 在使用前按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防乙醇挥发)8. 将离心管置于磁力架上静置 1 min,磁珠完全吸附后,吸去液体。
9. 将离心管从磁力架上取下,加 600 μl Buffer W2,旋涡充分混匀30 s。
(注 意:Buffer W2 在使用前按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防乙醇挥发)10. 将离心管置于磁力架上静置 1 min,磁珠完全吸附后,吸去液体。
11. 重复步骤 7 和 8 一次。
12. 将离心管置于磁力架上,开盖室温放置 5-10min。(注意:乙醇残留会抑制后续的酶反应,所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥过度,以免DNA 难以洗脱)
13. 将离心管从磁力架上取下,加入 50 - 100 μl Buffer EB,充分震荡1-2 min。
14. 将离心管置于磁力架上静置 1 min,磁珠完全吸附后,小心将溶液转移至新的离心管中,并于适当条件保存。
(注 意:为增加洗脱效率,可将洗脱液在 60℃预热。如需使用去离子水洗脱,可用NaOH调整其pH值在 7.0 - 8.5 之间)
MagPURE磁珠法质粒小提试剂盒
低拷贝或大质粒(>10 kb)提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒,应加大菌体使用量,使用5- 10ml过夜培养物,同时按照比例增加 Buffer S1、S2、S3 的用量,洗脱液Buffer EB应在60℃水浴预热,在吸附和洗脱时可以适当延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。
1. 细菌培养时间一般为 12 - 16 小时,如接种量大则应减少培养时间,过度培养会降低质 粒质量甚至导致质粒 DNA 突变。
2. 每次使用时都要注意 Buffer S2 和 S4 是否形成沉淀,如有沉淀37℃溶解后再用。
3. 注意溶液 S1,S2 和 S4 的用量比例,若细菌量增大,需按比例放大这些溶液的使用量。
4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。
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