一步法RT-PCR扩增试剂盒

产品特点

本试剂盒是专为一步法 RT-PCR 实验研制，逆转录和 PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。

本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动 DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和 PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的其它组分。SuperRT 逆转录酶RNaseH活性缺失，减少了逆转录反应中 RNA 的降解。该逆转录酶逆转录效率高，可对少量RNA模板进行良好的逆转录反应。PCR 反应使用的快速热启动 DNA 聚合酶具有扩增效率高、特异性强、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥功效。使用本试剂盒

扩增得到的目的产物 3′端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A克隆。

保存条件

长期保存，请置于-20℃，有效期 12 个月。使用后请及时放入-20℃保存以保证酶

的活性。

使用方法

1.　将 RNA 模板、引物、2×OneStep RT-PCR Mix 和 RNase-Free Water 溶解　并置于冰上备用。

2. 按下表加入试剂，至终体积 20 μl：

注 意：

引物浓度请以终浓度 0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情　　　　　　　　　　　况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

4. 设置反应程序，将 PCR 管置于热循环仪中，进行 RT-PCR 反应。

一步法RT-PCR扩增试剂盒

反应条件：

注 意：

A. 一般 PCR 实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，退火时间一般为20-30 秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。

B. 延伸时间根据扩增的片段大小设定，本产品中包含的 DNA Polymerase扩增效率为1 kb/30s。

C. 可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数)

5. 反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。

注意事项

1. 在操作过程中应避免 RNase 污染，防止 RNA 降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行 RNA 操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。? 

2. 实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用 0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃处理 12 小时，并在 120℃下高压灭菌 30 分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌 60 分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。

3.本试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。

4.本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到 RT-PCR 反应的结果，设计引物时需考虑 GC 含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。