免疫沉淀（IP）是一种可以纯化和富集目标蛋白的沉淀技术，在蛋白质组学研究中可用于识别蛋白质与蛋白质之间的相互作用。免疫沉淀是一种重要的技术，用于研究蛋白质之间的存在、相对丰度、大小、上调或下调、稳定性、翻译后修饰（PTMs）以及相互作用。以下为免疫沉淀实验常见问题及解决方案，希望对大家的实验有帮助。

一、背景高

1.样本中有不溶蛋白残留，离心后应立即取出上清。

2.洗涤不充分，优化洗涤缓冲液，通过向洗涤缓冲液中加入去垢剂（0.5-1%NP-40/Triton X-100/Tween-20）、增加盐离子浓度（如250mM NaCl/1-2mM DTT/β-ME），增加洗涤时间和次数来提高洗杂效率。

3.有非特异蛋白和磁珠结合，磁珠用BSA预封闭不充分，确保BSA新鲜，将磁珠和1%BSA 孵育1小时，使用PBS洗涤3-4次。

4.抗体特异性不好，使用亲和纯化，特异性好的抗体。

5.抗体用量太多导致非特异结合，尝试使用更少的抗体。

6.裂解液中蛋白含量太高，导致洗涤液有很多假阳性蛋白，减少样本用量。

7.蛋白和抗体非特异结合，可以在免疫沉淀之预先将磁珠和样本孵育，清理样本中可以和磁珠结合的成分，一些研究人员也使用同型对照来预清理裂解液。

8.样本中目的蛋白降解，样本裂解时严格低温操作，加入过量蛋白酶抑制剂。

9.高强度洗脱缓冲液（如SDS-PAGE上样缓冲液）将导致多种非特异蛋白和抗原一起洗脱，温和的缓冲液（如0.1M甘氨酸，pH2.5）可防止此类污染。

二、大量抗体被洗脱

抗体用量太高，尝试减少抗体用量。

三、没有检测到目的蛋白洗脱

1.样本中目的蛋白不表达或低水平表达，如果表达水平低，需要增加裂解液用量，但也可能导致非特异结合的增加，所以在免疫沉淀之需要预先清除裂解液。

2.抗体用量不够，检查抗体用量，提高使用量。

3.目标蛋白没有从磁珠上洗脱，需要确保使用的洗脱缓冲液正确。

4.抗体没有结合磁珠，确保使用的磁珠和抗体亚型匹配，磁珠正确保存，防止变质或干燥。

5.裂解液中盐碱度太高，需要改用低盐碱度裂解液。一般可选NP-40,RIPA, western及IP细胞裂解液。

四、加样顺序对靶蛋白得率的影响



磁珠、抗体、抗原样本混合一起孵育，速度快，但靶蛋白纯度和得率会很低。

间接法是抗体和抗原样本先结合，再加入磁珠孵育，靶蛋白得率高，直接法是磁珠先和抗体结合，再加入抗原孵育，对于表达丰度高的蛋白，两种方法差别不大，如果表达丰度低，要选择间接法获得更高的靶蛋白得率。

五、抗原洗脱方法的选择

七、二抗如何选择

原创作者：武汉菲恩生物科技有限公司