蛋白磷酸酶：负责磷酸化蛋白的去磷酸化

磷酸化主要是针对磷酸化位点制备的，可以特异性识别磷酸化氨基酸位点，检测蛋白磷酸化水平，对磷酸化蛋白进行定性、定量分析。磷酸化抗体可以用来检测该蛋白在细胞受到刺激时的磷酸化水平的变化情况，侧重于了解该蛋白的一种活性状态，哺乳动物细胞中约30%的蛋白质在一个或多个位点被磷酸化，不适当的蛋白质磷酸化是许多人类疾病的原因。

一个蛋白可以有多个氨基酸位点发生磷酸化，那么有哪些氨基酸容易发生磷酸化呢？下图展示了磷酸化类型以及常见磷酸化位点：

 O-磷酸化类型常见，在酸性条件非常稳定，因此在细胞生物学和磷酸化蛋白质组学中研究广泛。N-磷酸化不稳定导致其检测具有挑战性。S-磷酸化和酰基磷酸化的研究报道很少。

那么如何确定一个蛋白存在哪些磷酸化位点呢？下面以uniprot 网站为例给大家介绍下查找方法：

1.通过https://www.uniprot.org/链接进入uniprot 官网，主界面如下：

2.以人源TAU蛋白为例，在search栏输入TAU,进入如下界面，找到human TAU：

3.点击P10636进入后，点击左侧PTM/Processing查看蛋白修饰情况以及修饰的氨基酸位点：

磷酸化蛋白WB检测样本制备有哪些注意事项呢？

1.快、狠、准。蛋白磷酸化是一个快反应，制样过程要迅速，样品要新鲜，全程冰上操作。所有用到的试剂，器具要提预冷。制备的样本需要尽快变性并放在-80°保存，避免反复冻融导致磷酸基团降解。

2.裂解液中一定要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则条带出来会很浅。细胞裂解会释放大量内源性蛋白磷酸酶，会催化磷酸化蛋白去磷酸化。还要注意检测蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸位点磷酸化还要加1μmol/L的原钒酸钠。

磷酸化蛋白WB检测内参如何选择？

磷酸化蛋白检测需要设置2个内参，一个是普通内参比如actin或GAPDH, 确保上样量一致；另一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，比如检测AKT磷酸化，同时还要跑一个AKT总蛋白的抗体，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明书磷酸化水平发生改变了。

WB实验需要提高上样量吗?

磷酸化蛋白表达丰度低，大概只有总蛋白10%甚至更低，所以每孔需要足够蛋白量，必要时对细胞进行特定刺激提高磷酸化蛋白表达水平。如下图展示，FNab10910 anti- Phospho-p53 (Ser15) antibody ，UV刺激后细胞的磷酸化蛋白表达水平升高。

磷酸化蛋白检测用什么封闭液以及一抗孵育条件？

转膜后，建议用5%BSA封闭1小时，非实验别奶粉可能含有磷酸酶等杂质，不适用于磷酸化蛋白检测。封闭时间过长也会导致抗原标为掩盖。

一抗孵育建议4℃过夜，不仅让抗体有充足时间结合，低温环境使蛋白不容易从膜上脱落。