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技术文章
ELISA实验设计步骤详解及注意事项
点击次数：2883 发布时间：2024/4/18 16:13:10
ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速、定性或者定量的特点。
一、包被和封闭的原理
实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。
ELISA中的固相载体物很多，常用的是聚苯乙烯，具有较强的蛋白质吸附性。具有可制成各种形式，且不参与化学反应的特点。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯，它质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜；另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的。
在ELISA中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键。ELISA 所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化。重组抗原和多肽抗原均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰少的优势。但制备的技术难度较大，制备成本高。
将抗原或抗体固相化的过程称为包被。因为载体的物质不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板为载体时，需将抗原或抗体溶于缓冲液中，加于 ELISA 板孔中在 4℃ 过夜。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面能被此蛋白质全部覆盖，后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，产生非特异性显色，导致本底值偏高。在这种情况下，需要在包被后用其他溶液再包被一次，消除干扰，这一过程也被称为封闭。
二、实验设计
建议将96微孔板的两列设置为标准品点样孔，同时设置8个梯度浓度，2列复孔，将标准品工作液由低浓度到高浓度、依次从下至上加入酶标板中。
微孔板条的后10列可设置为待测样品点样孔，一般设置2~3个复孔。根据实验需求，可设置正常组、模型组、给药组等。根据检测的相关指标，选择是否稀释样本以及样本稀释的浓度。
三、实验操作
例如：Human IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit
检测试剂准备
提20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡到室温(18-25°C)。如果试剂盒需分多次使用，请仅取出本次实验所需的酶标板条及标准品，剩余酶标板条和标准品需按规定条件保存。
1.洗液：
用去离子水或蒸馏水(推荐电阻率为18MΩ的超纯水)将30ml浓缩洗涤液(48T为15ml)稀释至750ml(48T为375ml)并混匀。或依实验所需，取适量浓缩洗涤液稀释至25倍体积并混匀，将未使用的溶液放回2-8°C。
如果浓缩的洗涤液中形成了晶体，可以在40°C水浴中加热(加热温度不应超过50°C)，直至晶体全部溶解，混匀后使用。
配制好的洗液，建议当天使用完，用不完的，可以保存在2-8°C，不超过48小时。
②300pg/ml标准品(标记为零号管)的制备：加入1ml样品稀释液到标准品管中，旋紧管盖，室温静置2分钟，上下颠倒数次轻轻混匀(或加入1 mL样品稀释液，静置1-2分钟后，用低速涡旋仪混匀3-5)。1000×g低速离心1分钟，将液体收集至管底。
③倍比稀释：另取7个EP管，分别标记为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和blank。先在每个EP管中分别加入0.3ml的样品稀释液。再取0.3ml零号管标准品溶液加入到1/2管中，充分混合。再取0.3ml 1/2管标准品溶液到1/4管中，充分混合。再取0.3ml 1/4管标准品溶液到1/8管中，充分混合，依此类推。注意Blank EP管中仅有样品稀释液。此时，这7个EP管中标准品的浓度分别为150pg/ml，75pg/ml，37.5pg/ml，18.75pg/ml，9.375pg/ml，4.688pg/ml，0pg/ml 。
①计算所需工作液的总体积：100ul/孔×孔数。(准备比总体积多100ul-200ul的量)
②1000×g低速离心1分钟，将浓缩生物素-抗体收集至管底。
③用抗体稀释液按1:99的比例稀释浓缩生物素-抗体，充分混匀。(如将10ul浓缩生物素-抗体加入990ul抗体稀释液中)
4.HRP-链霉亲和素(SABC)工作液：
实验20分钟内准备好，现用现配，不适合长时间存放。
①计算所需工作液的总体积：100ul/孔×孔数。(准备比总体积多100ul-200ul的量。)
②1000×g低速离心1分钟，将浓缩SABC收集至管底。
③用SABC稀释液按1:99的比例稀释浓缩SABC，充分混匀。(如将10ul的浓缩SABC加入990ul SABC稀释液中)
2.加样：向标准品孔中加入100ul各梯度标准品，向样品孔中加入100ul待测样品，向空白孔中加入100ul 样品稀释液。贴上覆膜，并在37°C下孵育90分钟。(将溶液添加到微孔板的底部，轻轻晃 动混匀，并尽可能避免接触管壁和起泡。)
3.洗板2次：取下覆膜，吸去或甩掉酶标板内的液体，在洁净的吸水纸上拍2-3次。每孔加入洗涤缓冲液350ul，不浸泡，弃掉孔内液体，在吸水纸上拍2-3次。重复此洗板步骤 2 次。
4.加生物素-抗体工作液：向每孔加入100ul生物素-抗体工作液。贴上覆膜，37°C孵育60分钟。
5.洗板3次：取下覆膜，吸去或甩掉酶标板内的液体，在洁净的吸水纸上拍2-3次。每孔加入洗涤缓冲液350ul，浸泡1分钟，弃掉孔内液体，在吸水纸上拍2-3次。重复洗板步骤 3 次。
6.加HRP-链霉亲和素(SABC)：向每孔加入100ul SABC工作液。贴上覆膜，37°C孵育30分钟。(同时将整瓶TMB放入37°C温箱中平衡30min)
7.洗板5次：取下覆膜，用洗涤缓冲液洗板5次，方法参考步骤 5。
8.加TMB显色底物：向每孔加入90ul TMB显色底物，贴上覆膜，在37°C避光孵育10-20分钟。打开酶标仪预热15min。(注意：根据颜色的实际变化，反应时间可以缩短或延长，但不能超过30分钟。当标准孔中出现较好的蓝色梯度时，可以终止反应。显色强度不易太弱或过强，控制显色方法请查阅说明书第二页相关文件及二维码)
9.加反应终止液：显色后，孔内液体不可弃掉，向每孔加入50ul反应终止液。颜色将由蓝色立即变为黄色。添加终止液的顺序与添加TMB底物的顺序相同。
10.OD值的测量：立即用酶标仪在450nm处读取OD450数值并计算。
五、试剂盒使用时的注意事项
2.试剂盒开启后，酶标板和标准品的保存条件请参考组件保存条件表格(受潮后活性会下降)。如发生使用或保存不当导致组件缺损，可申请购买配套组件(如E002冻干标准品)。其它试剂按组件表格所示2-8°C存放即可。
3.提供的试剂体积比标签标明的稍多。使用时请使用无菌一次性吸头，使用后，须旋紧试剂瓶盖，以防止微生物污染和蒸发。
4.手工洗板时，加洗液的吸头或滴管，切勿接触酶标板孔。不充分的洗涤或污染容易造成假阳性和高背景。
5.检测过程中，请提准备好下一步实验所需试剂，洗板后及时将试剂加入板孔，防止板孔干燥，导致检测失效。
6.在未经确认的情况下，请勿将其他批次试剂盒的试剂或其他来源的试剂用于本试剂盒。
7.请勿重复使用一次性吸头，以免造成交叉污染。
8.加样完成，贴覆膜以防孵育过程样品的蒸发，在推荐温度下完成孵育过程。
9.试验中请穿实验服、戴口罩、手套等，做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品时，请按国家生物试验室安全防护条例执行。
不同的试剂盒实验操作步骤存在差异，耗时也有长有短。在实验时，注意仔细阅读说明书以及合理时间安排。再进行数据分析就完成啦！
原创作者：武汉菲恩生物科技有限公司
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