亲爱的科研小伙伴们，你是否曾在流式细胞术的实验中，为如何找到合适的抗体用量和抗体浓度而苦恼？现在，就让我们一起揭开抗体滴定的神秘面纱，让你的流式分析更加准确！

1.什么是抗体滴定？

抗体滴定，是流式细胞术中的一项关键步骤。它通过逐步稀释抗体，找到既能有效结合目标抗原，又能避免非特异性染色的适宜浓度。

一般抗体供应商都会推荐抗体使用量， 如菲恩生物包装抗体。但为了达到良好的实验效果及节省抗体，我们则需要自己做滴定，尤其在多指标流式检测实验中，抗体滴定就更加重要了。

2.为什么需要抗体滴定？

提升信噪比：合适抗体浓度能提升信号与噪声的比例，让你的数据更加清晰可靠。

节约成本：避免使用过量抗体，减少实验成本，同时降低样本自发荧光。

优化实验效果：不同实验条件（如细胞类型、实验方案、温度等）下，合适的抗体浓度可能不同，滴定确保每次实验都能达到良好状态。

3.抗体滴定的步骤

准备抗体稀释液：根据厂家推荐的起始浓度，进行倍比稀释，通常设置多个浓度梯度。

细胞处理：将待测细胞与稀释后的抗体孵育，确保抗体充分结合到细胞表面。

洗涤与重悬：去除未结合的抗体，减少背景干扰。

流式检测：使用流式细胞仪检测各浓度下的荧光信号，记录数据。

数据分析：计算染色指数（SI），选择合适的抗体浓度。

4.数据分析

染色指数（SI）：衡量阳性细胞群和阴性细胞群分离程度的指标，SI越大，分离效果越佳。

染色指数（SI）计算公式

选择SI越大时，对应的染色浓度作为合适的抗体浓度。

5.注意细节

1）关于全阳的细胞的滴定，可以在样本染色后加入未染色的细胞；

2）对于CD3、CD4、CD8这类分群明显且间隔非常开的指标，只做细胞性质确定设门用的时候，可不进行滴定，只滴定那些需要分析比例或MFI的指标；

3）对于表达量比较少的稀有细胞群体，在染色时，可加入该群细胞的父细胞群的抗体；

4）如果样本中有大量的死细胞，在滴定过程中，要先加入死活染料区分死活，细胞表达Fc受体时，需要加Fc受体阻断剂。

5） 在一定的细胞密度范围内，抗体的染色指数只与抗体的浓度有关，与细胞密度无关。比如染色体系不变，细胞增加10倍，可以不用增加抗体浓度。

原创作者：武汉菲恩生物科技有限公司