Annexin V-PI染色凋亡试剂盒

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合，将Annexin V标记荧光染料EGFP利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。
 

原理：
磷脂酰丝氨酸（PS）在正常细胞中只存在于细胞膜内侧，而在凋亡早期，PS由细胞膜内侧外翻至细胞膜外侧。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS特异性结合。AnnexinⅤ经过FITC、EGFP或PE标记后，作为荧光探针，即可通过PS特异性结合从而特异性标记凋亡早期细胞。

Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，但其不能通过活细胞的完整细胞膜，只能通过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此只能用来标记凋亡晚期细胞和死细胞。

通过AnnexinⅤ与PI联合标记，再经流式细胞仪或者荧光显微镜检测，就可以确定细胞是活细胞、凋亡早期细胞还是凋亡晚期细胞或者死细胞。

试剂盒组成
A液（Annexin V-EGFP）、B液（PI溶液）、Binding Buffer

实验步骤：
1. 悬浮细胞处理：收集细胞悬液，900rpm 3min离心去除培养基后用PBS润洗2次，再用Binding Buffer将细胞重悬为1x106个/ml的细胞悬液。
贴壁细胞处理：将细胞消化下来吹散后，离心去除胰酶及培养基后用PBS润洗2次，再用Binding Buffer将细胞重悬为1x106个/ml的细胞悬液。
2. 取100ul细胞悬液加入5ul A液与5ul B液，混匀后避光孵育10min。
3. 用荧光显微镜或者流式细胞仪检测结果。

注意事项：
1. 必须使用活细胞进行检测，不能使用破坏细胞膜完整性的试剂处理细胞。
2. 普遍认为PI有潜在致癌风险，操作时注意戴手套操作，避免交叉污染。
3. 孵育结束后，应尽量在1h以内检测结果，否则结果可能出现异常。
4. 细胞经过消化、离心、清洗后可能会出现凋亡增多的情况，因此必须注意操作尽量轻柔，离心转速和时间尽量低，尤其是贴壁细胞不要消化时间过长导致细胞提进入凋亡。
5. AnnexinⅤ是Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，因此消化细胞时尽量不要使用含EDTA的消化液，PBS也不要含EDTA等螯合剂。
6. 使用荧光显微镜检测时，可以将贴壁细胞直接接种在玻片上，实验时对细胞进行清洗染色后直接在玻片上观察细胞，避免消化损失细胞导致凋亡率增加。
使用流式细胞仪检测细胞时，可以根据实验需要设置阴性对照（未染色）、单染对照（Annexin V-EGFP、PI分别单染）以调整荧光补偿去除光谱重叠，同时根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。

荧光显微镜下检测效果