○ 样本收集

1、血液样本的收集：

全血根据收集的条件，分成不抗凝和抗凝两种。同时，不抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血清；抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血浆。

① 不抗凝收集血清:将收集好的全血,静置1～2小时，直接低速离心分离出血清待用或保存。

  ② 抗凝收集血浆: 收集抗凝全血，轻轻颠倒充分抗凝后，可直接低速离心分离血浆(也可静置半小时左右再低速离心分离血浆)待用或保存。根据不同抗凝剂的性能特征，选择合适的抗凝剂。实验室常用的抗凝剂有肝素的各种盐、EDTA及枸橼酸钠。生化实验一般建议用肝素抗凝。

选择抗凝的注意点：

① 每一份样本所加的抗凝剂的量要一致，同时所取的全血的量也要尽量一致；

② 收集抗凝全血后一定要轻轻颠倒，充分抗凝，防止部分血液未接触到抗凝剂而导致凝固;

   ③ 抗凝全血收集的血浆相对较多（1ml抗凝全血能分离出0.4～0.5ml血浆）；

                      ④ 抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去掉浑浊后

用于测定。

2、组织样本的收集:

① 样本采集：取组织块（一般每种组织需0.2g以上）在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入冻存管或离心管中。

② 样本保存：动物组织样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间如不反复冻融，-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。

制备好的匀浆液建议不要冻存,当天进行测定,如放置时间过长相关酶活会有所下降,部分指标4℃可存放3～5天(如SOD要存放2～3天,MDA可存放3～5,总蛋白测定可存5～7天等)

○ 样本的运输、转存

① 血液及组织样本收集齐后深低温冻存，将冻存的标本，放置在装有5-10公斤干冰的泡沫盒中密封保存运输。（干冰-40℃的温度，防止样本的反复冻融，5-10公斤的干冰可以5-7天的温度）

② 新鲜细胞可用充氮法。2-3天内送达；收集的细胞及裂解细胞冷冻液氮或干冰运输。

③ 细菌等样品冰袋低温运输。

④ 免疫组化石蜡包埋样品可加好固定液低温运输，或者包埋成蜡块后常温运输；免疫组化的冰冻样本液氮或干冰运输。

⑤ PCR相关实验使用收集细胞，可直接在细胞中加TRIzol充分裂解后用冰袋低温运输。

⑥ 客户所提供的试剂及试剂盒根据试剂本身保存要求运输。

○ 注意事项

① 本市可上门取样；外地客户请参照上述条件运输，快递送达；

② 干冰、液氮、冰袋等低温材料要充足，在运达目的地之没有消耗完。

血液样本：

全血根据收集的条件，分成不抗凝和抗凝两种。同时，不抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血清；抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血浆。

标本的存放温度及时间，血清、血浆及细胞分离的方法步骤也是分析影响检验结果的重要因素。抽血后，血细胞因代谢需要，要消耗掉部分营养成分，故对这些成分进行测定时，需及时地离心以分离掉细胞成分。

采血个体的准备情况，如空腹时间的长短、采样时间的确定及采血时患者的姿势；止血带应用时间，输液情况，体育运动，抗凝剂及稳定剂的选用；标本的处理等均可影响到某些检验指标的水平。故标本采集过程应标准化，以限度地减少分析误差。

一、不抗凝收集血清：

1、无添加剂的干燥空管收集:

血管内壁均匀涂有防止挂壁的药剂(硅油)。它利用血液自然凝固的原理使血液凝固，等血清自然析出后，离心使用。主要用于血清生化(肝功、肾功、心肌酶、淀粉酶等)、电解质(血清钾、钠、氯、钙、磷等)、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标志物、血清免疫学检测。
    亦可直接用干燥EP管收集全血，充分静置使得红细胞充分自然凝固后，离心分离出血清待用或保存。

2、用促凝管收集:

采血管内壁均匀涂有防止挂壁的硅油，同时添加了促凝剂。促凝剂能激活纤维蛋白酶，使可溶性纤维蛋白变成不可溶性的纤维蛋白聚体，进而形成稳定的纤维蛋白凝块，如果想快点出结果时，可采用促凝管。一般静置半小时到1小时，直接离心分离出血清待用或保存,常用于急诊生化。

3、含有分离胶及促凝剂的采血管收集：

管壁经过硅化处理，并涂有促凝剂可加速血液的凝固，缩短检验时间。管内加有分离胶，分离胶与PET管具有很好的亲和性，确实起到隔离作用，一般即使在普通离心机上，分离胶能将血液中的液体成分(血清)和固体成分(血细胞)分开并积聚在试管中形成屏障。离心后血清中不产生油滴，主要用于血清生化(肝功、肾功、心肌酶、淀粉酶等)、电解质(血清钾、钠、氯、钙、磷等)、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标志物、血清免疫学。

    用促凝管的优点：

①、加速红细胞的凝固，无需长时间的静置；

②、带有分离胶，有效的将血清分离出来，更好的避免溶血；

    收集血清的缺点：

①、需要红细胞的充分凝固，所需静置时间较长；

②、分离出的血清相对较少，1ml全血不抗凝约只能分离出0.2-0.3ml血清。

二、抗凝收集血浆：

收集抗凝全血，轻轻颠倒充分抗凝后，可直接离心分离血浆待用或保存。根据不同抗凝剂的性能特征，选择合适的抗凝剂。实验室常用的抗凝剂有肝素的各种盐、EDTA及枸橼酸钠。

1、肝素抗凝：

常用的抗凝剂，一般情况下对相关指标都不会有干扰，同时抗凝比例较大（抗凝剂：

全血=1:30），对血液基本没有稀释影响。

肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖，带有强大的负电荷，具有加强抗凝血酶III灭活丝

氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。肝素管一般用于生化及血流变的检测，是电解质检测的选择，检验血标本中的钠离子时，不能使用肝素钠，以免影响检测结果。也不能用于白细胞计数和分类，因肝素会引起白细胞聚集。

尽管用肝素的三种盐抗凝所得电解质浓度无显著差别，但肝素锂还是被认为是的。这主要是人们认为肝素钠可使钠的测定值偏高，肝素铵可使血氨测定值偏高（尿素酶法测定）。

肝素可抑制分子生物学中常用的一些工具酶，如限制性内切酶、Taq酶等，可影响PCR

的实验结果。可采用一些方法消除肝素的抑制效应，如利用肝素酶，或在分离白细胞后用缓冲液洗涤白细胞两次以上等。然而，许多实验工作者仍不愿意在进行分子生物学实验时采用肝素作抗凝剂。

2、EDTA抗凝：

乙二胺四乙酸是一种氨基多羧基酸，可以有效地鳌合血液中的钙离子，鳌合钙会将钙从

反应点移走将阻止和终止内源性或外源性凝血过程，从而防止血液凝固，与其他抗凝剂比较而言，其对血球的凝集及血细胞的形态影响较小，故通常使用EDTA盐(2K、3K、2Na)作为抗凝剂。用于一般血液学检查，不能用于血凝、微量元素及PCR检查。
    由于EDTA会螯合重金属离子，用该抗凝剂的话，部分带有金属离子的大分子酶都会有大量损失，具体看客户测定的指标来选择，做血常规的话必须用EDTA抗凝。

   3、枸橼酸盐抗凝:

柠檬酸钠通过作用于血样中钙离子鳌合而起抗凝作用，国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐为3.2％或3.8％，抗凝剂与血比例为1：9，主要用于纤溶系统(凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血酶时间、纤维蛋白原)。采血时应注意采足血量，以检验结果的准确性，采血后应立即轻轻颠倒混匀5-8次。由于抗凝比例较小（抗凝剂：全血=1:9），对血液有一定的稀释，一般不建议。

选择抗凝的注意点：

①、每一份样本所加的抗凝剂的量要一致，同时所取的全血的量也要尽量一致;

②、收集抗凝全血后一定要轻轻颠倒，充分抗凝，防止部分血液未接触到抗凝剂而导致凝固;

       ③、抗凝全血收集的血浆相对较多（1ml抗凝全血能分离出0.4-0.5ml血浆）;

       ④、抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去掉浑浊后

用于测定。

       血清、血浆收集好后，暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间如不反复冻融，-20℃以下可保存一个月,-70℃以下可保存三个月。

组织样本处理 （动物组织，肌肉 肝脏 肾脏 大便 植物组织等）

一、组织匀浆的制备

1、取组织块（0.1g～0.5g）少可到5～10mg在冰冷的PBS中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放入5ml的匀浆管中。

2、按重量(g):体积(ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。

3、匀浆的方式：手工匀浆，机器匀浆。

① 手工匀浆：左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，制成10%的匀浆液。

② 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000 转/分 上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10/次，间隙30，连续3～5次，在冰水中进行,可适当延长匀浆时间），镜检观察:

4、将制备好的10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机3000转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定.

二、匀浆介质  一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。

三、样本保存:         

植物组织样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间如不反复冻融，-20℃以下可保 存三个月,-70℃以下可保存六个月

细胞样本：a)对于贴壁细胞：去除培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照 6 孔板每孔细胞量加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。

b)对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照 6 孔板每孔细胞量加入 150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

2、后处理：

将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的ELISA、Western和免疫沉淀等操作。

原创作者：上海初态生物科技有限公司