备注：

1. （96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：80、40、20、10、5、0 μmol/L

3. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

检测准备工作：

1. 请提20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶完全溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃

3. 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。。

实验原理：

试剂盒采用双抗体二步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被植物维生素B12(VB12)捕获抗体包被微孔中，依次加入标本、标准品孵育，加入生物化抗体进行抗体生物素化，经过温育并彻底后加入HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物维生素B12(VB12)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

植物组织样本ELISA检测处理方法

一、组织匀浆的制备

1、取组织块（0.1g～0.5g）少可到5～10mg在冰冷的PBS中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放入5ml的匀浆管中。

2、按重量(mg):体积(ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。

3、匀浆的方式：手工匀浆，机器匀浆。

① 手工匀浆：左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，制成10%的匀浆液。

② 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000 转/分 上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10/次，间隙30，连续3～5次，在冰水中进行,可适当延长匀浆时间），镜检观察:

4、将制备好的10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机3000转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定.

二、匀浆介质  一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。

三、样本保存:         

1. 植物组织样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间如不反复冻融，-20℃以下可保 存三个月,-70℃以下可保存六个月

注意事项：

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

操作步骤：

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

（此图仅供参考）

试剂盒性能：

1. 检测范围：1.0 μmol/L – 80 μmol/L。

2. 灵敏度：低检测浓度小于1.0 μmol/L。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉感染，配置不同浓度标准品、上样、加不同试剂都需要更换枪头。另外不同试剂请分别使用不同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显色底物在上板应为无色，请避光保存；假如微孔板后，将由物色变成不同深度的蓝色。

5. 终止液上板顺序应同显色底物上板顺序一致；加入终止液后，孔内颜色由蓝变黄；若孔内有绿色，则表明孔内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1. 由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

2. 终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

3. 不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书仅作参考。

4. 只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到佳的检测结果。