常规的 PCR 扩增需要进行细菌培养、质粒制备等多步操作后才能进行基因扩增，操作繁琐， 耗时较长，同时在反复的操作中 DNA 量损失也较大，产率较低。在 1989 年 Gussow Clackson 建立了菌落 PCR (colony PCR) 法，菌落 PCR 与我们通常的普通 DNA 的 PCR 的不同在于，直 接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落，操作简单、快速，在转化鉴定中较常用

原理

菌落 PCR 实验的基本原理是以单个菌落作为模板，用无菌牙 签挑取单个菌落到 TE 缓冲液中，煮沸 10 min, 涡旋振荡后短暂离心，用 1〜2 国裂解液作为 DNA 模板，省去抽提模板 DNA 这一步，通过特异性引物或通用引物对目的基因进行快速扩增, 大大节约了时间和成本。

材料与仪器

器材：

固体平板培养基上培养出的单菌落、高压灭菌牙签、抗性平板、EP 管、离心机等。

试剂：

①10 × PCR 缓冲液 (100 mmol/L Tris-HCl, pH8.3, 500 mmol/L KC1; 0. 1% 明胶； 15 mmol/L MgCl2)

②目的基因引物

③Triton×100。

步骤

注意事项

1 菌落 PCR 时，加入菌液模板的体积不能过大，否则会影响 PCR 体系，导致扩增失败，一 般取 1〜2 μL 做 25 μL 的 PCR 体系。模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩增不出来，这种现 象在以质粒为模板的 PCR 里面很多，提出来的质粒不要忘记稀释。

2 减少扩增循环，25〜30 个循环对于菌落 PCR 是比较合适，扩增循环过多，会产生假阳性。

3 假阳性的控制。如果用载体引物来扩增一般可以降低假阳性，或者多用几对不同的引物 扩增，以增加真阳性的筛选结果，PCR 结果做酶切鉴定。

4 PCR 条件的控制。热启动可以消除引物二聚体，退火温度可以稍低。