环状质粒 PCR 构建定点突变序列，是指直接将全长双链质粒 DNA 以线性形式扩增，产生一种 DNA 双链上带缺口的突变质粒，该质粒经磷酸化后自身连接形成环状闭合质粒。

原理

环状质粒 PCR 构建定点突变序列的基本原理是限制性内切酶 Dpn I 特异性切割双链 DNA 中甲基化序列 Gm6ATC。从大肠杆菌中分离的质粒已在体内的内源性 Dam 甲基化酶作用下被甲基化了，因而对 Dpn I 的切割敏感，半甲基化的 DNA 被 Dpn I 切割的效率较低。相反，用四种通用脱氧核糖核苷酸体外合成的 DNA 没有甲基化，因而抵抗切割。在定点突变后，能用 Dpn I 降解剩余的甲基化了的野生型模板，从而富集体外合成的未甲基化 DNA。由于 Dpn I 选择性地破坏亲本模板，在 PCR 为基础的诱变中，这一方法的主要用途是净化合成的双链 DNA。 该方法以变性质粒 DNA 为模板，使用两条寡苷酸和高保真聚合酶引导 DNA 合成。经过多轮热循环后，全长双链质粒 DNA 以线性形式扩增，产生一种 DNA 双链上带缺口的突变质粒。 该质粒经磷酸化后自身连接形成环状闭合质粒。直接在 PCR 产物中或者在连接产物中加入限制性内切酶 I, 切割原始质粒模板及原始模板与新合成链的杂合体，转化大肠杆菌感受态, 根据突变体的复杂性和 DNA 模板长度不同，15%〜80% 的转化子克隆含有需要的突变体。图解示意如下所示。

材料与仪器

器材：

PCR 扩增仪、电泳仪、水平电泳槽

试剂：

①1mol/L NaOH 和 1 mmol/L EDTA 溶液。

②NaAc (3mol/L, pH4. 8)。

③TE (pH8.0)。

④10 X PCR 缓 冲液：内含 15 mmol/L MgCl2 , 500 mmol/L KC1, 100 mmol/L Tris-HCl（pH8. 3, 25°C）。

⑤10XdNTP 混合物：内含 2 mmol/L dGTP, 2 mmol/L dATP, 2 mmol/L dCTP 和 2 mmol/L dTTPo

⑥2 种寡核苷酸引物

⑦质粒 DNA 模板 

⑧热稳定 DNA 聚合酶。

⑨凝胶：含 0.5 g/ml 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶。

⑩ATP (10 mmol/L)。

⑪噬菌体 T4 多核苷酸激酶。

⑫ 噬菌体 T4 多核苷酸激酶缓冲液：内含 10 mmol/L MgCl2. 70 mmol/L Tris-HCl (25°C, pH7. 6)、5 mmol/L DTT。

⑬ 噬菌体 T4DNA 连接酶。

⑭ 噬菌体 T4 DNA 连接酶缓冲液：内含 10 mmol/L MgCl、50 mmol/L Tris-HCl (25°C, pH7. 5)、10 mmol/L DTT、1 mmol/L ATP。

⑮Dpn I 限制性内切酶及其缓冲液。

⑯大肠杆菌感受态。

步骤

注意事项

①通过 PCR 构建定向突变体时为了避免碱基的错误掺入，应使用带 3＇f 5』外切核酸酶校对 能力的热稳定 DNA 聚合酶，且该酶不能具有催化非模板性掺入腺昔酸残基能力。

②从理论上讲，模板量大将降低为获得足量产物所需的循环次数，也就减少了 Taq DNA 聚 合酶诱导的碱基错误掺入的机会。然而高浓度模板有妨碍顺利扩增的倾向。另外，扩增循环次数 过少会导致产生末端开放链，造成高本底。

③由于线性 DNA 片段转化效率低，在重组 PCR 中使用的感受态细胞转化效率要求非常高。

④在重组 PCR 中，如果质粒不能在 PCR 扩增部分的外侧被切开成线性，则必须纯化 PCR 产物，使其与质粒模板分开，而且如果以超螺旋质粒为模板，要进行更多次数的扩增循环，这是因为与线性模板相比，超螺旋模板 PCR 产物量要低。

⑤环状质粒 PCR 扩增反应混合物中 dNTP 和 Mg2+的起始浓度分别不要超过 250umoI/L 和 1. 5 mmol/L。

⑥环状质粒 PCR 线性扩增应保持在少循环次数，单碱基置换需要 12 个循环，单个氨基 酸置换需要 16 个循环，插入或缺失任何大小的 DNA 片段，使用 18 个循环，为了满足这一条件必须使用相对大量的模板 DNA。

⑦环状质粒 PCR 如果扩增反应正常但突变体产量低，应怀疑 Dpn I 酶的消化过程，必要时可调整 Dpn I 的用量和消化时间。

⑧环状质粒 PCR 如果突变效率高可不进行扩增产物的磷酸化和连接步骤，扩增产物可以直接转化大肠杆菌感受态。

⑨高保真热稳定 DNA 聚合酶延伸效率低于 taqDNA 聚合酶，延伸时间相对要长一些。

⑩少数 dam-缺陷大肠杆菌或来自其它宿主的 DNA 可用 Dam-甲基化酶进行体外甲基化。