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技术文章

高(G+C)含量DNA的PCR扩增实验2022已更新

点击次数:15579 发布时间:2022/8/10 23:51:56

 简介

高(G + C)含量 DNA 序列在生物基因组中广泛存在,有的高(G + C)DNA 片段占基因组中的一小部分,有的在基因组中几乎平均分布,在基因组 DNA 中局部片段(G + C)含量甚至可高达 80% 以上。由于 GC 碱基间可形成三个氢键,高(G + C)含量 DNA 单链或双链易形成复杂的二结构和三结构,所以,以高(G + C)含量 DNA 作模板,特别是以高(G + C)量基因组 DNA 作模板时,常常不能扩增出相应 PCR 产物,非特异性条带特别多,更不易扩增较长的 DNA 片段。因此,用 PCR 方法扩增高(G + C)含量 DNA 片段一直是 PCR 技术上的难点。目,用于高(G + C)含量 DNA 的 PCR 扩增实验的方法主要有【X】种:使用增强剂改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增、NaOH 对模板进行预处理改善高(G + C)含量 DNA 的 PCR 扩增和利用高温 PCR 体系改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增。

 

原理

使用增强剂改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟(G)和胞啥呢(C)碱基形成氢键,从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键,破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二或三结构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量,而且对于提高 PCR 产物的一性也有帮助,而在扩增较长片段高(G + C)含量 DNA 模板时,增强剂更是必不可少。至已有许多增强剂应用于高(G + C)含量 PCR 扩增,包括 DMSO(二甲亚碉)、甲酰胺、甘油、甜菜碱(betaine)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、7-脱氮-脱氧鸟嗦吟核昔三磷酸(7-deaza dGTP)、脱氧肌昔(deoxyinosine)以及其它小分子酰胺类(amides)、砚类(sulfones)和亚砚类(sulfoxide)等有机试剂。

NaOH 对模板进行预处理改善高(G + C)含量 DNA 的 PCR 扩增的基本原理是 DNA 在碱性溶液中不被降解,但一定浓度的碱性溶液可以破坏 DNA 的结构,使 DNA 处于变性状态。被碱变性的 DNA,在 PCR 反应中不仅易于进行延伸反应,而且易于与引物结合,使 PCR 扩增得以顺利进行。

利用高温 PCR 体系改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是高(G + C)含量 DNA 模板形成的二和三结构,在高温环境中呈现变性或不变性状态。为了不使变性的 DNA 在低温下再次恢复复杂结构,将整个 PCR 扩增过程包括变性、退火和延伸都处于高温条件,使用高 Tm 值引物和耐高温的 DNA 聚合酶,便可以扩增高(G + C)含量 DNA 模板。

 

应用

高(G + C)含量 DNA 的 PCR 扩增实验的常用应用域如下:

(一)高(G + C)含量基因或 DNA 片段的扩增

从低等放线菌到高等哺乳动物,基因组中都存在高(G + C)含量 DNA 序列,特别是放线菌 基因组中(G + C)平均含量超过 70%,而且有的基因长度超过 10 kb。为了研究这些高(G + C)含量基因的功能,或者对这些基因进行改造,都需要用 PCR 方法扩增或长或短的 DNA 片段。

(二)检测低丰度高(G + C)含量 DNA 序列

有一种疾病,在感觉神经节中感染了 I 型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV-1),这种病毒基因组测序已经完成,(G + C)平均含量为 69%,局部达到 80%,其中基因为 HSV-1 的代表序列,其(G + C)含量为 75.5%。为了检测处于潜伏期的 HSV-1,提取组织总 DNA,选取 ICP0 基因中的片段作为 PCR 扩增对象,使用常规 PCR 方法,或者在 PCR 反应体系 中添加 DMSO、甲酰胺,以及提高变性温度、使用热稳定 DNA 聚合酶等,都没有扩增出目的片 段。然而,在 PCR 反应体系中用脱氧黄噤吟(deoxyinosine)核昔三磷酸部分取代鸟嗦吟核昔三 磷酸(dlTP:dGTP = 1:4),可以使 PCR 产物检出灵敏度显著提高,如果用常规的 EB 染色灵 敏度提高 104 倍,如果用同位素标记 Southern 杂交,灵敏度可提高 106 倍。

(三)高(G + C)含量 DNA 片段序列分析

无论是基因组测序还是对克隆片段验证,都需要对特定的 DNA 序列进行测序分析,但高(G + C)含量的 DNA 片段在 DNA 测序时,由于复杂的空间结构使 DNA 测序信号很弱,或者测 序提终止。为了检验在瘤变过程中 c-jun 顶助相关基因的变化,先用 PCR 方法扩增研究对象,将 PCR 产物分离后,以其作模板直接进行测序。然而,由于目的片段中(G + C)含量很高,变性 形成的单链 DNA 很快复性,使测序无法进行。此时在测序反应体系中增加 10% DMSO,测序反 应即可顺利完成。研究结果表明,在 JB6 突变体中,其中的一个碱基已由 G 突变为 C。

(四)含高(G + C)含量 DNA 片段质粒的反向 PCR

反向 PCR(inverse PCR, iPCR)在基因突变研究中有重要应用,有关 iPCR 的原理和应用已 有门章节介绍。当质粒中克隆的外源片段(G + C)含量很高时,iPCR 往往难以完成。如在 pUC18 中克隆 1980 bp Actinomadura R39 DD〉 梭肽酶基因 [74%(G + C],使用 Taq、Tth、Vent 等多种 DNA 聚合酶,在用常规 iPCR 条件下是不能扩增 4.8 kb 长质粒的。然而,向 PCR 反应体 系中加入 10% 甲酰胺或 DMSO 时,使用 Vent DNA 聚合酶,即可扩增出完整的质粒。

原创作者:上海初态生物科技有限公司

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