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技术文章
实时定量 PCR 实验2022动态已更新
点击次数:15573 发布时间:2022/8/10 23:56:05
简介
实时定量 PCR( qPCR ) 于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司先推出。传统 PCR 方法可对特定 DNA 片段进行指数的扩增,并可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析,也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量分析。无论定性还是定量分析,都属于对 PCR 反应终产物的检测。但很多情况下我们更需要确定的是未经 PCR 信号放大之的起始模板量。由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃,而且与常规 PCR 相比,它具有特异性更强、结果准确可靠、自动化程度高等特点。
方法原理
方法应用
实时定量 PCR 技术主要运用在以下几个方面:
-
实时定量 PCR 技术应用在肿瘤诊断和研究方面
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实时定量 PCR 技术应用在基因突变及其多态性方面
-
实时定量 PCR 技术应用在病原体检测方面
材料与仪器
步骤
(一) 引物和探针的设计
检查比对序列,先选择好探针的位置,然后设计引物使其尽可能地靠近探针。
探针的设计原则是:
1. 尽可能短,不要超过 30bp;
2.Tm 值应在 68 - 70℃ 之间;
3. 避免 5'-端是鸟苷酸 ( G ) , 以免发生悴灭作用;
4. 选择胞苷酸 (C) 多于鸟苷酸 (G) 的链作探针,G 的含量多于 C 会降低反应效率。
(二) PCR 反应及数据记录
提取细胞或组织中的总 RNA、反转录 PCR。PCR 反应需要在实时定量 PCR 仪用反应板或管中进行,加入所有反应试剂后,将反应板置入仪器内,按照仪器操作说明完成反应和数据记录。
(三) 数据分析
一般而言,荧光扩增曲线可以分成 3 个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期,其形状是一条平滑的"S" 形曲线。
-
标准曲线法的绝对定量用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线。标准品可以是纯化的质粒 DNA , 体外转录的 RNA, 或者是体外合成的单链 DNA。
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标准曲线法的相对定量属于自身相对标准曲线。所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样品靶序列的量来自于自身标准曲线,终必须除以参照物的量。
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Ct 比较法的相对定量 Ct 是热循环仪检测到达设定的阈值荧光信号时所经历的循环数。假设每个循环增加 1 倍的产物数量,在 PCR 反应的指数期得到的 Ct 值反映起始模板的量,一个循环的不同相当于起始模板数 2 倍的差异。该方法不必制作标准曲线,但提是目的基因与内参基因要有类似的扩增效率。
注意事项
实时定量 PCR 过程中的常见问题有:
(一)影响特异性的因素
-
由于引物或探针降解、引物或探针设计不合理而造成的 Ct 值出现过晚或无 Ct 信号出现。优化方案是设计更好的引物或探针;优化引物浓度和退火温度。 避免引物或探针降解可在进行实时定量 PCR 实验通过电泳检测其完整性。
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模板有基因组的污染而出现非特异扩增。优化方案是在 RNA 提取过程中避免 DNA 的污染,或通过引物设计避免非特异扩增。
(二)影响重复性的因素
(三)标准曲线的线性关系不佳
原因可能是
1.加样不准,使得标准品不呈梯度;
2.标准品出现降解;
3.模板浓度过高。理想的标准品应与样品具有高度同源性,虽然标准品和样品之间的差异始终存在,在制作标准曲线时,应至少选择 5 个稀释度的标准品,涵盖待测样品中目的基因量可能出现的全部浓度范围。
(四)影响敏感度高低的因素
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特异性产物与引物二聚体竞争荧光染料 SYBR Green, 从而降低了实时 PCR 的敏感性。可用 TaqMan 探针代替 SYBR Green。
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使用热启动方法加强特异性。在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分,因为引物二聚体是在各种试剂一经混合便开始形成的,所以用这种方法能有效地减少引物二聚体的形成。
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要尽可能地优化引物设计。使两条引物的 GC 含量大致一致,使用纯化的引物进行实验等都有助于防止引物二聚体形成。
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Mg2 +的浓度。Mg2 +是影响 Taq 酶活性的关键因素。Mg2 +浓度过低无法使 Taq 酶发挥活性,浓度过高又会增加引物二聚体形成。一般来说,对以 DNA 或 cDNA 为模板的 PCR 反应,应选择 2 - 5 mmol/L 浓度的 MgCl2; 对以 mRNA 为模板的 RT-PCR 而言,则应选择 4 - 8 mmol/L 浓度的 MgCl2。
原创作者:上海初态生物科技有限公司