材料与仪器

切片
细胞通透液 乙醇 蒸馏水 双氧水 Triton X-100 羊血清 DAB Xylene 苏木精染液 双蒸水 中性树胶
微波炉 吹风机 组化笔 湿盒 烤箱 振荡器 染缸 光学显微镜 纯木浆卫生纸 计时器 通风橱

步骤

一.  试剂配制 

1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )

9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液，pH6.0）

28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。

3. 细胞通透液

由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用加0.4 ml 30％H2O2。

4. 5％羊血清或封闭血清，用PBS稀释。

5. 含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。

6. 一抗、二抗均用PBS稀释。

7. Xylene、梯度Ethanol（100％x2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。

8. 苏木精染液

二.  操作步骤

1.  脱蜡、水化 

（1）60 ℃x20 min→Xylene 2 x10 minutes；

（2）100% absolute ethanol：2 x5 minutes；

（3）95% ethanol 2 minutes； 

（4）80% ethanol 2 minutes；

（5）70% ethanol 2 minutes；

（6） distilled water：5 min；

（7）PBS洗3次x3 min。

2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶

（1）用封闭通透液浸润切片30 min（RT避光）。配法是用预热40 ml PBS加120 ul TritonX-100加热几分钟后，临用加400 ul 30％H2O2。

（2） PBS溶液洗3次x3 min。

3、抗原修复暴露抗原决定族

（1） 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 minx4次，每次间隔补足液体，防止干片。

4、封闭非特异性蛋白 

（1） PBS溶液洗3次x3 min；

（2）将切片取出，周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；

5、一抗孵育 

（1） 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。

6、二抗孵育  

（1）将一抗倒掉并用PBS洗5 minx5次；

（2） 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。

（3）用PBS洗5次x5 min；

7、SP反应

（1） 加入SP后放入37度烤箱中30 min。

（2） 用PBS洗5次x5 min； 

8、显色

（1）加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。
0.05％DAB（避光）（1：20储备液）：5 ul 20xDAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。 

9、复染、脱水、透明、封片

（1）用PBS 3次x3min后，用双蒸水洗5 min；

（2）加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。

（3）脱水



（4）透明

Xylene 1x(1-2) min→Xylene 2x(1-2) min

（5） 封片

中性树胶。

注意事项

常见问题

在镜检可以通过相关资料查询抗体的表达部位：细胞间质、细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核以及在其中的多个部位表达（如：MPO抗体表达在细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核上）和表达组织（如：VWF抗体在血管壁上表达，呈现环形）。
 

在显微镜下观察时，先在4倍镜下查找组织及其范围，然后查看整个组织确定阳性产物的表达部位，然后将阳性产物表达部位置于视野正中央，换高倍镜观察。