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果糖 1,6- 二磷酸醛缩酶紫外分光光度法2022已更新
点击次数:15617 发布时间:2022/6/11 19:36:33
货号:CT-C-B210 规格:50管/48样
果糖 1,6- 二磷酸醛缩酶
(Fructose 1,6 bisphosphate aldolase,FDA)试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:正式测定之选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
果糖 1,6-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)是糖酵解和糖异生途径中的重要酶,催化果糖 1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和 3-磷酸甘油醛,广泛存在于动植物及微生物体内,为生
物体合成代谢提供能量。
测定原理
果糖 1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,在磷酸丙糖异构酶和 α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和 α-磷酸甘油,340nm 处吸光值的变化可反映果糖 1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。
试剂组成和配制
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用加 5mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用加 5 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用加 5 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂五:液体×1 瓶,4℃避光保存。
酶液提取
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入1mL
提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3,间隔7,总时间3min);然后 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。
3. 液体:直接检测。
测定操作
1. 分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2. 取1mL石英比色皿,依次加入500μL试剂一,100μL试剂二,100μL试剂三,100μL试剂四,100μL试剂五,100μL粗酶液,充分混匀,记录 40nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,△A=A1-A2
计算公式
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T
=321.54×ΔA÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /g)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T
=321.54×ΔA÷W
(3)按照细胞数量计算
酶活单位定义:每 104个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /104cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T
= 321.54×ΔA÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /mL)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA
V 反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×10 3 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
注意事项
配制好的试剂二、试剂三、试剂四 3 天内使用完。
原创作者:上海初态生物科技有限公司