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4-香豆酸:辅酶 A 连接酶( 4-coumarate:CoA ligase,4CL)2022已更新
点击次数:15565 发布时间:2022/6/14 17:44:08
4-香豆酸:辅酶 A 连接酶( 4-coumarate:CoA ligase,4CL)
试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:
4CL 是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶,主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶 A 酯,是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理, 为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
测定原理:
4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA,在 333nm 下测 4-香豆酸 CoA 生成速率,即可反映 4CL 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 25 mL×1 瓶, 4℃保存; 试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;
粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪 40℃预热 30min 以上,调节波长至 333nm,蒸馏水调零。
2、 准备 96 孔 UV 板一块(非普通酶标板,普通酶标板只能透过可见光,不能透过紫外光, 检测波长小于 340nm 务必使用 UV 板)。
3、 样本测定
(1) 在试剂二中加入 10mL 试剂一充分溶解混匀,置于 40℃水浴预热 10min;现配现用( 配好后 24h 内用完);
(2) 在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二,混匀,立即记录 333nm 处初始吸光值 A1 和 40℃反应 30min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
4CL 活性计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=31.75×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.063×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm;
d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;
T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=63.49×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=63.49×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.127×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm;
d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;
T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
原创作者:上海初态生物科技有限公司