NADP 磷酸酶（NADPase）试剂盒说明书

可见分光光度法

正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

NADPase 主要存在于植物组织中，是生物体内催化 NADP⁺降解为NAD⁺的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。

测定原理：

NADPase 能够催化NADP⁺水解为NAD⁺和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase 活性。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 30 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×5 支，-20℃保存；用时每支加入 1 mL 试剂一充分溶解备用，现配现用。

试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。

试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。

试剂五：液体 25mL×1 瓶，室温保存。

试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂六20倍稀释，即取0.5mL试剂六加9.5蒸馏水，充分混匀。

定磷试剂的配制：按 H₂O:试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样本的处理：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

操作步骤：

1、 酶促反应

37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30min 后，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心 5min，取上清

2、定磷

混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 30min，冷却至室温，在 660nm 处，蒸馏水调零，记录各管吸光值。

注意事项：

1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，*后用蒸馏水冲干净。用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。

2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。

原创作者：上海初态生物科技有限公司