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荧光定量PCR（QPCR）
点击次数：16发布时间：2023/11/27 10:10:18
更新日期：2024/4/12 9:27:24
所 在 地：中国大陆
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实验概念
RT-PCR即逆转录pcr,其原理是提取组织或细胞中的总RNA，利用Oligo(dt)或随机引物反转录，获得cDNA模板，进一步通过PCR反应获得目的基因产物或检测其表达水平。与其他技术相比，RT-PCR技术更加灵敏易于操作，在细胞/组织基因表达水平的半定量检测，特定基因cDNA克隆及RNA病毒检测等分子生物学域得到广泛应用。
实验流程
样本接收→引物合成→提取总RNA→RNA浓度测定→逆转录成cdna→荧光定量PCR→数据分析
注意事项
1.普通PCR及realtime PCR样本 注意事项 | ||||
样本形式 | 处理方式 | 保存 | 运输 | 可检测指标数 |
新鲜组织 | 1、0.1g新鲜组织(至少) | 液氮或-80℃ | 干冰 | 3-5个 |
2、 加入1ml的Trizol（可选） | ||||
细胞 | 1、 培养基吸出弃掉，用PBS洗涤两次后，吸弃PBS。 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 2-3个 |
2、 每1*10^6个细胞加1ml TRIzol，细胞刮板挂或吹打使细胞脱落，吹至拉丝状，收集之后冻存备用。 | ||||
全血 | 1、大于等于2ml全血加入EDTA或肝素抗凝。 | 4℃ | 冰袋 | 3-5个 |
| 2、4h内进行淋巴细胞分离 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 询问 |
体液 | 1. 12000rpm/min离心10-20min，取沉淀 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 询问 |
1.组织在1-2min内完成取材，速冻，，并立即放入-80℃或液氮中保存。 | ||||
实验结果
扩增完毕后，进入结果分析界面，看CT值、起始拷贝数、标准偏差等，如果是SYBR做的话，再看下溶解曲线。以β-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。
