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技术文章
抗体文库细胞筛选
一．细胞筛选原理
细胞表面分布着大量的信号分子，它们反映了细胞的特性以及所处的功能状态。虽然可以将分子直接作为筛选标靶，但对于纯化困难或表达量少的受体等分子，它们需要完整的细胞膜，或者与细胞膜上的其他亚单位形成复合物才能发挥作用。
二．全细胞筛选的优缺点
| 优点 | 缺点 |
| 1、不需要对受体分子进行纯化，也不需要分析受体结构，且受体处于天然构想状态，其真实的结合活性； 2、不需要预先确定具体的目的受体，可以寻找细胞表面未知受体及其配体分子； 3、还能够筛选到内在化的受体，用于某些疾病靶向药物的开发； 4、可与细胞功能实验相结合，直接筛选到对某种细胞膜分子的功能及细胞表型有影响的活性肽。 | 1、细胞膜表面具有大量的生物活性大分子，其多样性和结构的复杂多变性使非特异性结合占有很高的比例； 2、反复数轮的“吸附-洗脱-扩增”会使细胞与特异性结合配体的损失严重； 3、有些蛋白在细胞中的表达量很少，当表达量低于文库中任何一个多肽的亲和力常数时，就很难得到预期的效果； 4、细胞膜上的其他蛋白或糖基造成的空间结构可影响对目的多肽的结合。 |
三．全细胞筛选策略
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| 筛选已知细胞表面受体 | 筛选未知细胞表面受体 |
| 基本思路 | 在培养皿中培养抗体库中不含目标受体的空白细胞，去除非目标抗体（即阴性筛选），然后用未吸附的噬菌体与目标细胞结合，获得与目标细胞结合的抗体（即阳性筛选），经过几轮“阴性筛选-阳性筛选-扩增”，就能富集出特异性抗体。 | 筛选细胞表面的未知受体往往会得到针对细胞表面大量分子受体的抗体，因此必须避免抗体与正常组织之间的交叉反应。有必要选择合适的阴性细胞来筛查背景，提高信噪比。 |
| 缺点 | 在阴性选择过程中，非特异性噬菌体不能被有效屏蔽，在阳性筛选过程中，一些拷贝数小的阳性克隆容易丢失，富集的抗体克隆大多是非特异性的，在数量和多样性上都远不如纯抗原。 | 在受体抗原性质不确定、功能受体表达稀缺的复杂抗原环境中，筛选往往会受到受体偏差和多样性的干扰，使筛选效率低下，产生较高的筛选背景。此外，该技术操作难度大，回收的噬菌体少，抗体亲和力低，开发价值不大。 |
四．细胞筛选的实验流程
(1) 细胞处理：筛选用细胞中加入EDTA，4℃、1000rpm离心10min；
(2) 洗涤：处理好的细胞用无血清DMEM培养基4℃、2000rpm离心1min，洗涤1-2次；
(3) 孵育噬菌体：取提制备的噬菌体溶液加入至筛选细胞中，加入DMEM培养基，4℃孵育2h；
(4) 洗涤：孵育好的细胞用无血清DMEM培养基4℃、3000rpm离心1min，洗涤8-10次，再用PBST洗涤3次；
(5) 洗脱：4℃、3000rpm离心5min离心，弃去上清，加入Tris-HCl(pH=3.0)，重悬细胞，4℃、4000r离心5min，迅速用Tris-HCl(pH=8.0)中和至约pH=7.0。
(6) 活化2738：取两支离心管，倒入LB 液休培养基，加入四环不素，其中一支加入从2738平板上挑一个单个菌落，另一支做空白对照，37℃，250r的摇床内培养4h。
(7) 洗脱产物稀释：取3支无菌的1.5ml离心管，分别加入无菌的LB培养基，向1管内加入脱产物，混匀，取出加入第二支管內，混匀，再从第二管取出加入第三管内，混匀。
(8) 侵染：取3支无菌的离心管，分别加入活化好的2738菌液，及稀释的洗脱产物（一个梯度一支管），在37°C放置1.5h。
(9) 倒板：向侵染的菌液加入3-4ml 己加过IPTG及x-gal的上层胶，混匀，倒在IPTG+X-gal的平板上（平板需先在37℃培养箱内预热至少1h），放在37°C培养箱内，培养过夜。
五．当比较成功的细胞筛选方法主要有：
(1) 差减筛选：应用该方法从噬菌体抗体库中筛选靶向黑色素瘤细胞的抗体。举例具体操作：先用黑色素瘤细胞进行几轮阳性筛查，然后用正常黑色素瘤进行阴性筛查，以扣除不与阳性细胞特异性结合的抗体。由于细胞表面抗原浓度低，加上演绎筛选的固有缺陷，这种筛选方法非常困难。
(2) 细胞内化筛选：某些抗体与细胞表面抗原结合，抗原-抗体复合物可以被吞噬到细胞中，因此可以使用细胞内化筛选方法来筛选此类抗体。有研究证明，这种筛选方法是可行的，而且比细胞表面筛选更容易获得特异性噬菌体抗体。
六．全细胞筛选法的应用
全细胞筛选法可应用于寻找新的受体、配体及抗原表位分析，新型肽苗的开发，基因治疗靶向载体的筛选，肿瘤靶向治疗载体的筛选，酶受体激动剂和拮抗剂的开发，疾病的检测及治疗等多个方面。
泰克生物具有完善的上下游对接服务，包括抗原、抗体的表达纯化、抗体人源化、重组抗体表达等服务。在文库构建方面具有成熟稳定的技术，噬菌体展示技术提供1免疫文库的建库库容为108-109，插入率均满足>95%，筛选获得的抗体亲和力普遍处于nM-pM别。具备多种筛选体系，包括直接筛选法、竞争法、负筛选法、细胞筛选法等，可提供VHH筛选、scFv序列筛选、Fab抗体筛选等，满足不同客户的不同需求。产品交付标准高：针对免疫库，交付免疫后血清，抗体展示文库，筛选洗脱产物，CDR区域补充度的纳米抗体序列，QC质控标准（含RNA提取，cDNA制备等）。
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原创作者：泰克生物科技（天津）有限公司
